【主要組成成分】

需要但未提供的材料及耗材

 1、能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標儀，參考波長 570 nm 或 630 nm。

2、移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、1L量筒

7、無粉一次性乳膠手套

8、稀釋用聚丙烯試管

【儲存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

  3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體，有效期為28天，其他成分在標簽標明的有效期內是穩定的。

【適用儀器】

  半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產酶標儀。

【樣本要求】

  樣本類型和采集

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、細胞培養上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

2、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。

樣本保存和穩定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【試劑準備】

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復至室溫。

如果濃縮的試劑出現結晶，37℃溫浴，直至結晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水或去離子水至 1000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。

轉移至干凈瓶內。2 - 25℃貯存，1×洗液可穩定 30 天。

1×檢測緩沖液

吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水或去離子水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。

2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩定保存 30 天。

檢測抗體

稀釋前充分混勻。根據標準品和待測樣本的數量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢測抗體。

注意：請在 30 分鐘內使用稀釋后的檢測抗體。

辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素

稀釋前充分混勻。

根據標準品和待測樣本的數量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

注意：請在 30 分鐘內使用稀釋后的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

樣本稀釋

如果樣本需要稀釋，請用試劑盒提供的 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細胞培養基稀釋細胞培養上清

人轉化生長因子β1(TGFβ1）標準品

用蒸餾水或去離子水重溶人轉化生長因子β1(TGFβ1）標準品，重溶體積標注在人轉化生長因子β1(TGFβ1） 標準品的標簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標準品的濃度為 1000 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。

請使用聚丙烯管進行標準品稀釋。

血清/血漿樣本標準曲線的制作：

取 200μl 濃縮的人轉化生長因子β1(TGFβ1）標準品，加入 200 μl 標準品稀釋液，作為標準曲線的高濃度 (500 pg/ml)。在每一個試管中加入200 μl 標準品稀釋液。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。以標準品稀釋液作為標準曲線的零濃度。

細胞培養上清樣本標準曲線的制作：

取200μl濃縮的人轉化生長因子β1(TGFβ1）標準品，加入 200 μl 細胞培養基，作為標準曲線的高濃度 (500 pg/ml)。在每一個試管中加入 200 μl 細胞培養基。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移液時，確保充分混勻。以細胞培養基作為標準曲線的零濃度。

1000 pg/ml     

【操作程序】

1、所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品按前面試劑準備中描述的方法配置好，并建議做復孔。

2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

3.加入 350 μl 1×洗液靜置浸泡25 秒。為了獲得理想的實驗結果浸泡是必須的。棄掉洗液之后， 在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4.每孔加入 50 μl 1×檢測緩沖液。

5.復孔加入 50 μl 2 倍倍比稀釋的標準品，空白孔復孔加入 50 μl 標準品稀釋液。樣本孔加入 50 μl樣本。

6.每孔加入 50 μl 稀釋的檢測抗體。保證步驟 4、5、6 連續加樣，不要間斷。加樣過程在 10 分鐘內完成。

7.使用封板膜封板。300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育 2 小時。

8.棄掉液體，每孔加入 350 μl 洗液洗板，洗滌 5 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。

9.每孔加入 100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

10.使用新的封板膜封板。300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育 45 分鐘。

11.重復步驟 8。

12.每孔加入 100 μl 顯色底物 TMB，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。

13.每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍色變為黃色。如果顏色呈現綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

14.在 15分鐘之內，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定 450 nm 大吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長下的 OD 值。校準后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導致 OD 值偏高，并且準確度降低

【檢驗結果的解釋】

計算標準品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標準品的 OD 值。

檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，回歸分析確定佳擬合曲線，創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的終濃度 

【檢驗方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于標準曲線高濃度，請用檢測緩沖液稀釋樣本，并重新檢測。如果細胞培養上清樣本需要較大的稀釋倍數，請用細胞培養基進行適度稀釋。

6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排除該因素。

7、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

【產品性能指標】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。

2、劑量反應曲線線性

校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9900。

3、度

批內度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。

批間度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。

4、靈敏度

低檢出劑量小于3.2pg/ml。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組人轉化生長因子β1(TGFβ1），與結構類似物無交叉。

  穩定性

    2℃-8℃保存，有效期6個月。

【注意事項】

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后徹底洗手。

4、試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼睛、手及面部的設施。

5、本試劑盒用于科學研究，不能用于診斷治療。

6、請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒中的試劑。

技術要點

1、重溶或者混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加標準品與樣本時，每個標準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變為藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變為黃色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。