產(chǎn)品特點：

● 使用方便,無需超速離心,省時省力；

● 純度高,富集量大,應用范圍廣；

● 獲取的Exosome結(jié)構(gòu)和功能完整；

● 穩(wěn)定性好,便于運輸,便于保存。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

●離心機 ●移液器 ●離心管 ●吸頭

使用注意事項：

● 以下以2mL乳汁/唾液為例，實際操作時按血清樣本和提取液用量體積比等比例調(diào)整使用即可。

● 不同乳汁/唾液樣本外泌體數(shù)量差異極大，請根據(jù)實際情況選擇乳汁/唾液樣本的量，根據(jù)下游應用和參考文獻確定。條件允許情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 常規(guī)的乳汁/唾液樣本最佳上樣量為3-5mL及以上，條件允許的情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 已經(jīng)分離好的外泌體樣本如果需要進行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時間不超過兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會影響電鏡觀察效果。

使用方法：

外泌體提取：

1. 收集2mL待提取的乳汁/唾液樣品，置2-8℃保存。

【注】：

● 凍存樣品解凍后置2-8℃保存。

● 最好使用新鮮樣本，冷凍樣品外泌體回收率會降低。

2. 將樣品在4℃條件下，3000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。

3. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

4. 將樣品在4℃條件下，10000×g離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。

5. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

6. 在2mL乳汁/唾液樣品中加入2mL提取液A，蓋緊離心管蓋。

7. 輕輕上下顛倒混勻1分鐘左右，使液體充分混勻。制備成4mL待提取外泌體懸液（I）。然后進行下列外泌體純化步驟操作。

清洗外泌體純化離心管D(大)：

1. 用緩沖液或純水進行預清洗。

2. 離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用,則讓液體保留在濾膜上,直到使用。

【注】：

● 可以在外泌體提取步驟中需要使用前再清洗。

● 重復使用時要仔細檢查管壁上有沒有裂紋。

外泌體純化：

1. 將外泌體純化離心管D(大)內(nèi)管插入所提供的一個配套離心管中。

2. 向內(nèi)管中加入過4mL的待提取外泌體懸液（I）樣本，并蓋上蓋子。

【注】：

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時,必須防止碰到濾膜,以免戳破濾膜。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時,可以用藍吸頭(1mL)；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時,必須用黃吸頭(200μL)。

3. 將蓋好蓋子的外泌體純化離心管放入離心轉(zhuǎn)子中,用一個類似的離心管平衡。

【注】：

● 最好使用非固定角度的轉(zhuǎn)子。

● 使用固定角度轉(zhuǎn)子時,將白色膜片面朝上放置。

● 如果使用固定角轉(zhuǎn)子，最好適當減少待提取外泌體懸液體積，可以加至3.5mL。

4. 以4000×g 離心約10-15 分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請監(jiān)控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測試完成。

避免吸頭戳破濾膜導致外泌體損失。

● 影響流速的因素包括樣本濃度、相對離心力、離心轉(zhuǎn)子的角度以及溫度。常見樣本的典型離心時間大約是10至20分鐘。大部分樣本在離心開始后的前5至10分鐘發(fā)生過濾純化，但在離心10至20分鐘后才能達到最低的純化液體積（20μL）。

● 可以將濃縮的外泌體用PBS或HEPES等緩沖液（根據(jù)下游實驗需要選擇）稀釋，再次離心至大約剩余50μL-100μL，這樣的外泌體純度將再次提高，殘余的外源蛋白質(zhì)和核酸更少。

5. 在50-100μL殘余液體中加入2mL外泌體提取液B。

6. 以4000×g離心約10-15分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請監(jiān)控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測試完成。

避免吸頭戳破濾膜導致外泌體損失。

7. 離心結(jié)束后將整個離心管從離心機中取出，取出內(nèi)管。

【注】：

● 外泌體可能會有少量的吸附損失，吸附損失取決于外泌體濃度、與過濾純化內(nèi)管表面接觸的溫度和時間。為了最大限度降低損失，離心后請立即回收過濾后的外泌體樣本。

8. 為了回收純化后的外泌體，用200μL移液器插入純化管的底部，吸出純化后的50-100μL 純化外泌體懸液（II）。

【注】：

● 要達到理想的回收效果，請盡快吸出純化外泌體懸液。

● 從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時，必須用黃吸頭。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 注意確保外泌體懸液完全吸出。

9. 套上外泌體純化離心管E（小）的液體收集管，將純化外泌體懸液（II）吸入外泌體純化離心管E（小）的離心管（內(nèi)管）中，在4℃，11000-13000×g條件下離心10-15分鐘。

【注】：

● 外泌體純化離心管E（小）重復利用，一般一個離心管可以用5-10次。

● 外泌體純化離心管E（小）內(nèi)管對外泌體沒有吸附，離心后可以直接重復使用。

● 如果需要清洗離心管，可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000×g離心10 分鐘即可。

10. 吸取外泌體純化離心管E（小）的收集管中的液體，即得到外泌體樣品純品。

【注】：

● 可以根據(jù)下游實驗需要，用相應的緩沖液稀釋保存外泌體。

● 也可以用試劑盒中配的外泌體保存液稀釋保存外泌體。

● 也可直接用于外泌體蛋白提取。

● 將外泌體樣本-80℃保存或直接用于下游應用。

● 外泌體短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上長期不用時置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm或0.35μm濾器過濾除菌。

11. 用純水或緩沖液洗滌兩種大小的內(nèi)管和收集管，繼續(xù)純化下一個樣品。

【注】：

● 洗滌內(nèi)管時，加入400μL PBS緩沖液或其它緩沖液，用吸頭反復吹打，吸掉緩沖液即可。

● 用PBS洗滌3-4次。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 每個離心管內(nèi)管建議重復使用5次，不要超過10次。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時，可以用藍吸頭；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時，必須用黃吸頭。

● 如果使用過的離心管需要長期保存，可以按下列方法清洗和保存離心管內(nèi)管。

外泌體純化離心管(大)清洗和保存：

1. 使用后用水沖洗干凈；

2. 內(nèi)管加入超純水4mL，4000×g離心5分鐘；

3. 吸凈內(nèi)管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g離心20分鐘；

4. 用0.1M NaOH浸泡24小時；

5. 用水沖洗干凈；

6. 用無菌水浸泡2-8℃保存。

7. 外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

【注】：

● 1個月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長時間的話加0.02%的疊氮鈉。

● 再次用前，用純水充分沖洗干凈，然后根據(jù)下游實驗需要，用相應的緩沖液平衡。

常見問題分析：

● 如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測（形態(tài)）、粒徑檢測（大小）、外泌體標志蛋白Western blot檢測等方法鑒定提取的外泌體。

● 外泌體WB標志蛋白用什么？

在進行WB 檢測時，通常檢測外泌體標志蛋白為CD63、CD9、CD81、TSG101 、ALIX、HSP70等。

● 進行外泌體WB 鑒定時有什么內(nèi)參蛋白可供選擇？

沒有，該檢測屬于定性檢測。

● 蛋白濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。請選擇高質(zhì)量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

● 抽提得到的RNA濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

● 外泌體純化管內(nèi)管膜會因為離心時間過長而變干么？

不會，因為內(nèi)管有死體積，總會有溶液殘留在內(nèi)管中。死體積大約10-20μL。

● 可以重復使用過濾管么？

可以重復使用。如果使用、清洗、保存得當，可以反復使用多次。但是超過8次重復使用后過濾膜有破損風險，注意使用過程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過大。

● 外泌體在純化時出現(xiàn)了沉淀，如何改進？

如果過濾過快或者過度濃縮都有可能引起沉淀。如果樣品的外泌體濃度很高，建議降低最終的外泌體濃度，保留更多的液體。

對于因過濾速度敏感而導致的沉淀，建議的改進方法是：

1）離心力降低30%-50%

2）在過濾過程中取出過濾管，用槍頭反復吹吸幾次。

● 有時候用外泌體純化離心管連水都離不下來，可能是什么原因？

如果出現(xiàn)這種情況，可能時過濾膜的孔被堵住。請先用0.1M NaOH清洗再離心。

最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。

● 說明書中推薦在室溫下進行離心，考慮到外泌體的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進行離心？

可以，但是低溫可能會增加外泌體樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長。