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價格：電議
所在地：北京
型號：HR9069-100T
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更新時間：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀區紫雀路33號院3號樓
18518407031(微信同步） 
王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
產品特點：
● 使用方便：可用熒光顯微鏡直接拍照；
● 背景低，靈敏度高；
● 線性范圍寬，使用方便。
檢測方法：
● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦顯微鏡
樣本類型：
● 新鮮冰凍切片 ● 振動切片
試劑盒以外自備試劑和儀器：
● 熒光顯微鏡/激光共聚焦顯微鏡激發波長535nm，發射波長610nm。
● PBS/HBSS(無酚紅)
使用注意事項：
● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。
● 對于某些樣本，如果熒光太強，可以按照1:200-1:2000稀釋探針。探針標記的時間也可以根據情況在20-60分鐘內適當進行調整。
● 冰凍切片制作不需要經過固定脫水包埋等步驟，直接冷凍后切片貼片。
● 有條件也可采用振動切片的方法。有些方便處理的樣品類型也可采用徒手切片。
● 以下操作步驟僅供參考，請根據實際樣本情況調整。
使用方法：
一、 試劑配制
1、根據樣本數，用純水將DHE探針200-2000倍稀釋，配成染色工作液。
【注】：
● 不可以一次性將探針全部稀釋。現配現用。
● 不同樣本的ROS差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-2000倍稀釋，500倍稀釋適合大多數樣本。
● 如果熒光強度太強，可以增加稀釋倍數。最大可以稀釋至5000倍。
● DHE探針液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。
● 微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。
● 以下步驟使用的DHE探針為此步驟稀釋過的探針工作液。
2、用純水將10×清洗液10倍稀釋，配成1×清洗液工作液。
二、 探針標記
1、準備待測的厚為10-20μm的未經固定處理的冰凍切片。
【注】：
● 必須使用新鮮組織(手術切除后1小時內)制成的冰凍切片/振動切片。
● 否則不新鮮的樣本可能ROS已經流失，檢測不到活性氧。
● 非新鮮樣本殘余的ROS也可以檢測到。
2、室溫下，小心加上200μL清洗液工作液，鋪滿整個切片表面，靜置3-5分鐘。
3、小心吸除清洗液。
4、滴加100-200μL染色工作液，在37℃培養箱避光孵育20-60分鐘。
【注】：
● 最好在濕盒中孵育，避免液體蒸發。
5、移除染色液。
6、用PBS洗滌切片2-3次。
7、加蓋玻片或甘油封片。
8、激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測。
【注】：
● 染色完成后，立即進行熒光定性分析。
● 激發波長535 nm，發射波長610 nm。
● 熒光強，表明活性氧(ROS)含量高。
● 拍照后，用相應的圖像分析軟件進行光密度分析。可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氧(ROS)程度差異。
常見問題分析：
● 活性氧結果如何分析？
ROS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值(目標/參照)。反映的是模型樣本通過具體的干預措施(如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等)如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。
● 熒光照片如何分析？
需要有相關的熒光強度分析軟件。ROS 表達水平直接通過熒光信號的強弱和分布范圍來體現。
有的顯微鏡掃描下來的圖像本身就可以測面積和強度，可以同時測不同顏色的熒光強度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測量指標進行分析。
要結合明場的照片具體分析。如果細胞分布均勻可以算固定面積熒光強度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細胞分布不勻，需要找到細胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。
如果要用圖片做結果，就要平行做多個圖片，作分析，統計，每張都要求熒光分布盡量一致。
為了去除雜光的影響，可以適當調節統計熒光的強度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。對照組和實驗組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數均要一致。
對于不同情況熒光強度的統計方法，根據實驗需要或參考文獻。可以算等面積的平均強度；也可以算閾值高于一定值的平均強度；也可以算熒光的累積而不算平均。
要根據課題需要選擇合適的測量統計方法。
● 熒光照片效果不好？
熒光拍照存在很多變量，每一個變量都會嚴重影響拍照效果。
熒光拍攝條件：拍攝環境、顯微鏡品牌和激發熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強度。
熒光衰減：熒光物質的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時內拍攝和8小時后拍攝，熒光效果完全不同。
最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優。
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