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特別提示：包括dì高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：dì高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)
產品貨號：ZN1518
產品規格：1盒

保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探針的隨機引物標記及各種膜上雜交和原位雜交。
工作量：可用于標記0.1—3μg的探針 6次及 1000 張切片的原位雜交或12次 10×10cm 膜上雜交檢測。
原理：
所謂 DNA 探針，實質上是一段已知的基因片段，應用這一基因片段即可與待測樣品雜交。
如果靶基因和探針的核苷酸序列相同，就可按堿基配對原則進行核酸分子雜交，從而達到檢查樣品基因的目的。在隨機引物法標記反應液中，有隨機合成的六聚體核苷酸(hexanucleotide)作為引物，
dATP、dCTP、dGTP、dTTP和 D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成摻入dì高辛的DNA 鏈。以dì高辛標記的探針與靶基因DNA 鏈雜交后，再通過免疫反應來
進行檢測。一般通過酶標抗dì高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應的存在。
免疫檢測采用過氧化物酶系統，DAB 顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。特點：
(1)標記屬標記反應。以1μg DNA 探針為例，1 小時反應即可產生0.8μg 標記探針，20 小時可產生2μg 左右的標記探針。
(2)試劑將標記反應所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow 酶等混合在一起。一次標記只需吸取一次標記液，使用至為簡便。
(3)標記反應適于下述對象：
a.DNA 從10ng—3μg。
b.不等的DNA 長度100bp—10kb。
c.線形排列或呈高度卷曲之DNA。
d.低融點瓊脂中的DNA。
(4)檢測系統抗體為抗dì高辛單抗+SABC。抗dì高辛單抗標記生物素，效價1：1000-2000(膜上雜交)或1：1000(原位雜交)。
(5)顯色劑為DAB，非常穩定。用時1：40 稀釋。
(6)試劑盒敏感性達到0.1pg，足夠檢測出1μg 基因組DNA 中的單個基因。
(7)除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。
操作程序：
一 隨機引物標記操作程序如下：
①用滅菌去離子蒸餾水稀釋 1μg DNA 至總體積 16μl。
②DNA 熱變性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分鐘。然后，迅速地插入碎冰中 3分鐘以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(),混勻后再離心 2000/r.p.m×5分鐘。
④置 37℃反應至少 120分鐘。時間越長，產量越高。延長反應時間至 20 小時可明顯增加dì高辛標記DNA的產量。應根據需要控制反應時間。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反應，對于原位雜交和膜上雜交反應來說，標記反應可告結束，上述反應液置-20℃保存至少一年以上。且可反復使用。
二 核酸探針膜上雜交原理和操作
(一)雜交總原則
脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長鏈構成 DNA的一級結構。兩條堿基互補的多核苷酸鏈按堿基配對原則形成雙螺旋，構成 DNA的二級結構。某些條件(如酸堿、有機溶劑、加熱)可使氫鍵斷裂，DNA 雙鏈打開成單鏈重新結合。所謂雜交，是具有一定互補順序的核酸單鏈，DNA 單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補原則結合成異源性雙鏈的過程。
(二)雜交膜的選擇
雜交膜可以選擇硝酸纖維素膜和尼龍膜。硝酸纖維膜的優點在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復雜交。尼龍膜分為帶正電荷的膜和不帶電荷的膜兩種。帶正電荷的尼龍膜對核酸結合力強，敏感性也較高。不帶電荷的膜結合力低，相應敏感性也較低。尼龍膜的優點在于雜交用過的膜，用洗脫液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分鐘后去除探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結果不滿意，如背景太高或顯色不強，也可洗去探針之后重新雜交。
(三)探針濃度
探針濃度是獲得理想雜交檢測的關鍵因素，濃度太高則會導致本底太深；若濃度太低又會導致信號減弱。為了解決過高探針濃度所引起的高背景，必須進行模擬雜交實驗。
所謂模擬雜交實驗，即選擇幾小片雜交膜，在未轉移 DNA的情況下，進行封閉、不同濃度的探針孵育及隨后的免疫檢測。以背景能被接受的zuì高探針濃度為正式雜交實驗的濃度。模擬雜交實驗不 同濃度的探針可以參考下述方法配制：取 5μl 標記反應液加 1ml 探針稀釋液，混勻。取 0.5ml 等倍釋后，再取 0.5ml 繼續等倍稀釋。假設 20μl 標記反應液中含 1μg 標記的探針，則系列稀釋探針的濃度分別是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)預雜交和雜交液
預雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅僅是預雜交液中不含有探針。下面是幾種基本雜交液配方：
①Standard buffer：5×SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
②Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。
③High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5 ×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段經電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975 年 Southern 發明了利用濃鹽溶液的推動作用將變性的單鏈 DNA 轉移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉移的問題。雖然其原理和操作均很簡單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經得到了廣泛的應用。
Southern 印跡雜交包括兩個主要步驟①把電泳分級的DNA 轉移到固相支持膜上。②與標記的DNA 探針雜交。
1．Southern 轉移
先將 DNA 用限制性內切酶消化。準備一定濃度的瓊脂凝膠。瓊脂凝膠必須是高純度和核酸級的。電泳后經溴化乙錠染色并在紫外燈下照相后，將需要轉移的瓊脂糖凝膠切下，放入搪瓷盤中，然后進行下面的步驟。
試劑
a.0.25M HC1
b.變性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 檸檬酸鈉,3M Nac1
e.2×SSC：0.03M 檸檬酸鈉,0.3M Nac1
程序：
(1)將膠浸入 0.25M HC1 中 10分鐘。HC1 處理的作用主要是通過去嘌呤使 DNA 分子斷裂，因而有利于高分子量 DNA的轉移，但不能處理時間過長。要轉移全部小于 10kb的DNA片段時可省略此步驟。
(2)進入變性液之前，用蒸餾水漂洗20-30分鐘。
(3)把膠浸入變性液中，室溫浸泡 15分鐘×2次。
(4)蒸餾水漂洗凝膠 2次。
(5)把膠浸入中和液中，室溫泡 15分鐘×2次。
(6)在處理凝膠的同時，切一張與膠同樣大小的尼龍膜或硝酸纖維膜。硝酸纖維膜用 2×SSC浸泡。
剪兩張 Whatman3#濾紙和一疊吸水用的粗濾紙注意不能用手指直接觸及膜面。
(7)準備轉移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭濾紙橋使溶液能夠虹吸上來。
(8)依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水濾紙，玻璃板，適量重物(500-1000g)
注意：要檢查 PH 值，用硝纖膜時 PH<9。要確保各層間沒有氣泡，否則會發生局部“緣”，氣泡處的DNA 難以被吸到硝酸纖維膜上。
(9)于室溫轉移 12-20 小時。
(10)取出轉移膜，用 2×SSC 漂洗數次，以去掉可能粘附于膜上的凝膠。
(11)固定：可選擇下述方法之一進行 DNA 固定
·紫外線固定：使用長波紫外線照射 10-20分鐘，簡單漂洗后干燥備用。
·尼龍膜置+120℃烘烤 30分鐘。
·硝纖膜置真空烤箱中，80℃減壓烘烤 2-2.5 小時，以避免硝纖膜自熔。若無真空烤箱，亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小時，也能達到固定目的。固定后，將膜封于塑料袋中，保存于干燥處待雜交。
注意事項①轉移液的鹽濃度對轉移具有一定影響。應選擇 20×SSC 快。10×SSC 轉移速度較快，對于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比較理想。因此要根據不同目的選擇適當的轉移液。
②轉移時不能移動上邊重物，防止出現“重影”現象。
③硝酸纖維膜對于 0.5kb 以下的小分子 DNA 結合不牢，轉移時容易丟掉。要探測小片時zuì好用尼龍膜。
2 ．Southern 印跡雜交雜交成功的關鍵因素之一在于選擇雜交液。應通過預實驗來選擇合適的雜交液。另一個比較重要的因素是標記探針的濃度，一般選擇 5-25ng/ml，應通過模擬雜交實驗來選擇合適的探針濃度。
試劑
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①將轉移好的尼龍膜或硝纖膜裝入塑料袋中，每邊各留 2-4mm 空隙。灌注雜交液的一邊留1cm 空隙。在角上剪開一個小口，灌注預雜交液，從切口處趕走氣泡，用封膜機封口，浸入水浴中。
②根據所選擇的不同預雜交液，采用不同的溫度預雜交 4-20 小時：Standard buffer:預雜交溫度 65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。
③使用雙鏈 DNA 探針時，沸水浴 10分鐘以變性探針。然后迅速插入冰中。
按模擬雜交實驗所確定的探針濃度將適量探針加入到預雜交液中，配成雜交液，一般濃度5-25ng/ml。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制雜交液。
④使用和預雜交相同的雜交溫度，一般雜交 16-20 小時。
⑤雜交結束后，取出雜交袋，剪開一個小口，將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20℃以備下次使用。這樣至少可保存一年。再次使用之前應在凍融之后，加熱至+95℃10分鐘以變性探針。雜交液如含有 50%甲酰胺，則在 68℃變性 10分鐘即可。
⑥取出雜交膜，用 Wash Solution I洗5分鐘×3次。
⑦保溫沖洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃沖洗15分鐘×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此檢測方法用于快速定性篩選 DNA。樣品可以是純化 DNA，也可以是細胞碎片 PCR 擴的DNA。預雜交和雜交方法與 Southern 基本一致，不同的僅是樣品的處理不同。
試劑：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序
①將樣本DNA稀釋成不同濃度。
②將樣本DNA于+95℃水浴 10分鐘，迅速插入冰中。
③取 1μl點樣至尼龍膜或硝纖膜上。點樣前先畫上圓卷做記號。
④用紫外線照射固定或+120℃烘烤30分鐘固定。
其后雜交步驟 Southern 相同
(七)DAB 顯色檢測法
試劑：
a．.Biotin—Mouse Anti—Digoxin 200μl
b．SABC—POD 200μl
c．DAB Stock Solution 5ml
d.沖洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
e.封閉液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
f.顯色緩沖液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。
g.TE 緩沖液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
1．經過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡 1分鐘。
2．用干凈的雜交袋或平皿，封閉液室溫封閉60分鐘。
3．用沖洗液沖洗5分鐘×3次，每次100ml 。
4．用封閉液(e)1：1000-2000 稀釋 Biotin—Mouse Anti—Digoxin，例如 10μl Biotin—Mouse Anti—Digoxin 加至 10-20ml 封閉液中(稀釋液+4℃可穩定 24 小時左右)。將適量稀釋抗體加入雜交袋中 37℃反應 1-2 小時。
5．用沖洗液沖洗5分鐘×3次，每次 100ml 。
6．用封閉液(e)1：1000-2000 稀釋 SABC，例如 10μl SABC 加至 10-20ml 封閉液中(稀釋液+4℃可穩定 24 小時左右)。將適量稀釋 SABC 加入雜交袋中 37℃反應 1-2 小時。
7．用沖洗液沖洗15分鐘×3次，每次 100ml。
8．按 1：40 配制底物顯色液：250μl 儲備液加至 10ml 顯色緩沖液中，用前加zuì終濃度為0.03%的H2O2，室溫顯色5—30分鐘左右。當所需要的顯色點或帶出現之后，蒸餾水洗以終止反應。結果可以進行照相記錄。還有一種選擇是讓膜干燥保存。
三 原位雜交
所謂原位雜交是指在保存染色體、細胞或組織結構的前提下，用探針定位檢查出相關基因序列。結合免疫細胞化學，原位雜交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表達。
原位雜交技術zuì早 Pardue and Gall和 John etal。分別在 1969 年發現。zuì初，放射性標記技術是的方法，其使用受到明顯限制。由于非放射性標記技術的簡單、高敏感性，為原位雜交技術廣泛應用開避了道路。
(一)染色體原位雜交的一般技術
1 玻片準備
為了展開染色體，酒精清潔玻片即可。但為了防止細胞和組織的脫落，必須用多聚賴氨酸或APES 處理玻片。
2 固定
為了保存形態結構，生物材料都必須予以固定。染色體的固定比較簡單，甲醇/乙酸固定即已足夠。如果是石蠟包埋組織，采用福爾馬林固定。冰凍切片采用 4%甲醛或Bouin"s 固定液固定30分鐘。應予注意的是，DNA和 RNA 雖然不和各種交聯劑反應。但包圍 DNA.RNA的各種蛋白質和交聯劑反應后，就會遮蓋住靶核苷酸。因此，必須采取各種增加通透性的程序。
3 玻片上材料的預處理
a．內源性酶的滅活
如果用酶作為標記物，內源性酶必須預先予滅活。如過氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇30分鐘處理。至于堿性磷酸酶，由于雜交過程的破壞，殘余堿性磷酸酶的活力會完全消失。
b.RNA 酶的處理—DNA-DNA 雜交時需要處理內源性 RNA。
內源性 RNA的存在，會由于 DNA-RNA的雜交而增加背景。處理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分鐘。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1處理用200mM HC1 處理 20-30分鐘可以增加信/噪比值，其機理尚不清楚。可能與蛋白的抽提和部分功能核苷酸片斷的溶解有關。
d.去垢劑處理
在脂膜成分未被固定，脫水、包埋等程序抽提時，可以進一步使用去垢劑處理，如 Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同樣有助于原位雜交技術。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增進探針和核苷酸之間的接觸性。消化通常用蛋白酶 K，溶于 20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分鐘。蛋白酶 K 濃度依不同對象來確定。
例如對染色體和核的分離部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探針和靶基因的變性
對染色體 DNA的原位雜交，必需進行變性處理。熱變性越來越常用，它不僅簡單，而且效果很好。對不同的雜交，應試驗不同的時間和溫度，以找到zuì佳的變性條件。
熱變性時，探針和靶基因可以同時變性。將探針加到玻片上，蓋上蓋玻片。玻片放到 80℃，2分鐘后取出冷卻至 37℃。如果是組織切片，變性時間應達到 80℃10分鐘。組織和細胞 mRNA的雜交則不需變性處理。
5 雜交后的沖洗
標記探針能夠和其序列具有部分同源性的基因非特異性的雜交。這類雜交分子的穩定性總是不及完全同源的雜交分子。分別用不同強度沖洗液可以有效地洗掉非特異雜交的/探針，而保留特異雜交的探針。沖洗液的強度可通過改變甲酰胺濃度、鹽濃度和溫度來控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺來沖洗。有時可用更高強度的沖洗液。總的來說，雜交時用高強度緩沖液，沖洗時用低強度的沖洗液(鹽濃度越低，甲酰胺濃度越高和溫度越高，則沖洗強度越大)。
6 免疫細胞化學
免疫細胞化學和常規方法一樣，必須行非特異性的封閉處理。如探針為dì高辛標記時，Tris-HC1 緩沖液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。免疫細胞化學中zuì常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶。前者用 DAB 作顯色劑。后者用 BCIP/NBT 作顯色劑，方法同膜上雜交。顯色強度由顯微鏡下控制。
7 影響原位雜交的主要因素
a.探針長度：原位雜交和其它雜交方法不同，它要求較短的探針。因為探針越短，滲透性越強，可以滲透至細胞內部和染色體。不同的雜交所允許的zuì小核苷酸如下述公式所計算：
b.探針濃度：濃度越高，則雜交速度越快。但過高的濃度也會使背景增加，因此，宜選擇可接受背景的zuì高探針濃度。
c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物質，因此使得大分子(如探針)難以接觸到其結合水，相對濃度大大增加，雜交速度明顯加快。
d.堿基錯配：堿基錯配會引起雜交速度及二倍體的穩定性下降。因此在嚴格的雜交條件下，可以阻止探針與靶基因的非特異結合。
e.沖洗條件
8 雜交標準條件
適于 DNA 探針〉100bp
⊙50%去離子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙載體 DNA
任選組合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
溫度 37-42℃
雜交時間：5-16 小時
(二)組織切片的原位雜交
目前，原位雜交已成病理學的一個有力工具，原位雜交可以用于諸如病毒，癌基因，基因突變等領域的檢查。尤其是非放射性標記探針技術，為更多的實驗室廣泛應用原位雜交創造了條件。對福爾馬林固定、石蠟包埋切片的原位雜交，關鍵是以下三個步驟：
①靶DNA的暴露。這要靠精心設計的消化步驟。
②DNA的變性和雜交。
③雜交的分子的沖洗和檢測。
1 探針的準備
2 玻片的處理
①去污劑浸泡一晚，大量自來水沖洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙酮中 3分鐘。
③玻片移入 1：50 丙酮稀釋的APES 溶液中，浸泡 5分鐘。
④玻片用蒸餾水略加清洗。干燥備用。處理后的玻片置干燥無塵環境可保存半年。玻片也可用“多聚賴氨酸”處理。
3 組織切片的準備
①組織用常規 4%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋。
②常規切片。切片撈于涂有粘片劑的玻片上。
③切片處理：先置 60℃烘片 30分鐘。
二甲苯脫蠟，逐級酒精至水清洗。
④臨用前配制蛋白酶 K 溶液：
儲備液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。將儲備液用 TES 稀釋成 100μg/ml。
(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每張切片用 Proteinase k 20-30μl 37℃消化 5-15分鐘。消化過程中加蓋硅化蓋玻片，并置濕盒中。注意消化對組織原位雜交是至關重要的。過度消化會導致切片消失殆盡，消化不足則敏感性不夠，因此應針對不同組織嘗試不同的消化條件。
4 雜交
①蛋白K消化后，去除蓋玻片。用4%甲醛 4℃固定5分鐘。
②蒸餾水洗5分鐘。
③讓切片上水分滴下去，并在室溫干燥 5分鐘。注意只能讓切片上水份減少，不能讓切片完全干燥。④每張切片加 5-10μl 探針(大切片需相應增加)。
⑤設立嚴格的對照組，每張切片加 5-10μl 不加探針的雜交液。
⑥切片上加硅化蓋玻片，將玻片置+95℃變性 6分鐘。
⑦把玻片放到冰上 1分鐘。
⑧切片置溫盒，42℃雜交 3 小時以上。如果方便，應雜交過夜。
5 沖洗
去掉蓋玻片，按下述程序沖洗
2×SSC洗5分鐘×2次(室溫)
0．1×SSC洗10分鐘(42℃)
6 雜交分子的免疫檢測
①切片置于 0．1M TBS 緩沖液中，PH7．4
②每張切片加 20-40μl 封閉液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。室溫反應 15分鐘。
③用封閉液 1：1000 稀釋 Biotin—Mouse Anti—Digoxin ,每張切片加 20-50μl 稀釋試劑，濕盒室溫反應 1-2 小時。用 0．1M TBS洗5分鐘×3次。
④用封閉液 1：1000 稀釋 SABC，37℃反應 60分鐘。0．1M TBS洗10分鐘×3次。
⑤配顯色劑：將 DAB 儲備液用 0．1M PBS，PH7．5 緩沖液 1：20 稀釋。加zuì終為0.03%H2O2。
每張切片加 50μl，一般顯色 5-30分鐘。信號弱時顯色延長。
(三)細胞的原位雜交
下面的程序是用標記DNA 探針來檢測培養細胞中的mRNA。其它類型的檢測可以參照此程序進行。1 細胞準備，固定和增加通透性注意：所有溶液都必須用 RNase 抑制劑處理。
①玻片用多聚賴氨酸處理。直接用 5% CO2 在玻片上培養細胞。所用培養基為無酚紅Dulbecco"s 基礎培養基。
②37℃PBS 清洗細胞。然后用下述固定液室溫固定 30分鐘：4%甲醛，5%乙酸和 0．9%NaC1。
③室溫 PBS 清洗固定細胞，用 70%乙醇儲存于 4℃
④雜交前用下述方法脫水：70%，90%和 乙醇；10%二甲苯；然后再用 ，90%，70%乙醇，zuì后PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化固定細胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分鐘。
⑥PBS洗5分鐘后，1%甲醛固定 10分鐘。PBS洗。
其余步驟參照組織切片程序實行。

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名稱：PCR法DNA探針標記試劑盒
貨號：BTN90604A
規格：5次
PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zuì后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：


產品特點：
1.一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規PCR(用于制備標記反應的模板和設置對照反應)和5次50μl體系的標記反應。
3.一次標記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規格
2×標記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準備工作
1. 按常規的方法設計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 根據PCR引物優化PCR條件。
3. 由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產物，再以之為模板制備標記的PCR產物。
二：非標記PCR產物的制備
4. 設置50μL PCR的反應體系：

成份	用量
2×標記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質粒DNA
超純水	補到50μL

5. 按已經優化的PCR參數進行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產物(具體取決于PCR產物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續的標記PCR。
三：標記PCR反應(zuì好做一個不加標記的對照用于定量)
說明：在設置下面反應時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，這種復性會與探針-靶DNA雜交反應相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標記：探針引物一和引物二 單鏈標記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產物 (單鏈標記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補到50μL	補到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經進過優化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到35-55個循環。由于模板為純化后的PCR產物，探針對擴增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好)，所以可以增加循環數；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規的dTTP慢；三是降低復性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應和對照反應的產物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應的PCR產物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產物(但同位素標記不能用此法)。
 注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結合EB的能力遠低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區域折疊形成的有限雙鏈區，因此能結合的EB很少)，因此EB染色的強弱不能準確反應DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標記產物可以不經過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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