2015年值得關注的五大技術
發布日期：2015-01-10 瀏覽次數 ：700
【導讀】激光層照熒光顯微技術能以很高的3D分辨率，長時間對生物學樣本進行溫和成像。這一技術結合高速相機，足以捕捉細胞或亞細胞水平發生的動態。
日前，《Nature Methods》雜志將這個低光毒性的快速三維成像技術評為了2014年的年度技術。
激光層照熒光顯微技術的基本原理很簡單，它不像寬場或共聚焦顯微鏡那樣照射或掃描整個樣本，而是用薄層光從側邊照射樣本，然后從樣本的上部或下部檢測熒光，激發光路與檢測光路垂直。激光層照熒光顯微鏡激發一個層面上的熒光基團，一次成像一個面，這種技術不僅大大降低了光毒性，還提高了長時間成像活樣本的能力。
Light-sheet技術始于一百年前，原本是用來成像膠體的。后來，Ernst Stelzer等人用這一技術成像了熒光標記的活斑馬魚胚胎，Light-sheet技術由此重新煥發了活力。Stelzer在本期Nature Methods雜志上撰文，介紹了這一技術的起源、原理和應用潛力。
激光層照熒光顯微技術的崛起，離不開熒光蛋白和轉基因標記的發展。實際上，只有物理學、生物學等多個領域進行跨學科合作，人們才能充分挖掘出這一技術的潛力。隨著商業化儀器的不斷推出和升級，相信激光層照技術將為我們揭示以往難以想象的生物學細節。
2015值得關注的技術之二：DIA質譜
傳統的蛋白質組學采用數據依賴采集（DDA）策略，將蛋白質樣品消化成肽段，離子化并通過質譜進行分析。在全掃描質譜圖中，高于噪音的肽段信號被選擇性裂解，產生隨機（MS/MS）質譜，能夠與數據庫中的圖譜相匹配。盡管這種方法非常強大，但它隨機抽取肽段進行裂解，總是偏向于那些信號強的峰。因此，低豐度肽段的定量仍是挑戰。
早在兩年前，《Nature Methods》就將年度技術頒給了靶向蛋白質組學技術。在成熟的定向分析技術——選擇反應監測（SRM）中，質譜儀能非常靈敏地檢測到特定肽段，具有高的定量準確性。然而，這種方法并不適合于發現型的應用。
因此，蛋白質組研究界如今將目光集中在數據非依賴采集（DIA）上，它在理論上綜合了DDA和SRM的。在DIA分析中，質荷比（m/z）窗口內的所有肽段都經過裂解；分析重復，直至質譜儀覆蓋整個m/z范圍。這實現了準確的肽段定量，而不限于分析預先定義的肽段。
盡管DIA的概念早在十年前就被引入，但直到近開發出一些實際的DIA應用，它才重新點燃了人們的興趣。蛋白質組學領域的許多科學家都看到了DIA的潛力，認為它有望解決DDA所面臨的問題，但其他人并沒有留下深刻的印象。《Nature Methods》的編輯AllisonDoerr認為，也許DIA還需要進一步應用到更具挑戰性的生物問題，才能展示它的。
2015值得關注的技術之三：深度成像
要了解器官或組織的結構和功能，是在其完整狀態下進行研究。正因如此，透視器官深處一直是生物學家的一大夢想，現在能實現這一夢想的技術已經觸手可及。
一般來說，要對不透明的生物樣本進行深度成像是非常困難的。為了克服這個問題，人們開發了許多“透明化”方法。CUBIC、iDISCO和PACT都能使固定樣本的組織透明化，并且保留熒光標記的信號。這樣的技術將會滲透到多個領域，為人們解決各種各樣的問題。（延伸閱讀：Cell：透明小鼠實現系統生物學終夢想）
不過，上述透明化技術并不適合活體樣本。在這種情況下，我們需要通過其他途徑來減少樣本的光散射和提高透明度。舉例來說，我們可以使用非線性激發（比如雙光子顯微鏡）或者近紅外光成像，近紅外光在生物組織上有較深的穿透能力。近人們還開發了遺傳學編碼的近紅外探針和納米顆粒，特別適合非侵入性的癌癥研究和活細胞追蹤。更長波長的成像技術，將實現更深的組織穿透。
2015值得關注的技術之四：微小晶體的結構
大家都知道，通過X射線衍射確定原子結構時，先你得有大的、結構良好的蛋白質晶體。這說來容易做來難。許多蛋白質，尤其是膜蛋白，無法形成大的晶體，往往形成納米或微米大小的晶體。在幾年前，這種微小的晶體基本上被認為是沒用的，因為在衍射數據記錄之前它們就會受損。不過，新的技術如今也能從這些晶體上獲得高質量的數據。
一種方法是飛秒X射線晶體學，其中微小的晶體涌入飛秒脈沖的路徑，這些脈沖來自其明亮的X射線自由電子激光裝置（XFEL）。X射線的脈沖非常快，因此在晶體被破壞之前就能收集衍射圖像。自2011年引入這項技術之后，它經過快速發展，并不斷擴大應用范圍。
2014年，這項技術帶來了新的結構和見解，并不斷改進將微小晶體引入XFEL光路以及數據分析的方法。去年，地區擁有XFEL的研究機構——日本理化學研究所發表了一些生物學成果。而在未來幾年，德國和瑞士XFEL設施的建設也有望完成。
2015值得關注的技術之五：新一代CRISPRs
當人們提到所謂的使能技術），類似印刷機的發明，或者麻醉藥的發現就會浮現在我們腦海中。而對于科學家來說，CRISPR-Cas9系統就是這樣一種系統。
這種細菌免疫系統能通過將病毒DNA中的短重復片段整合到細菌基因組中，來抵抗病毒。當細菌（或其后代）第二次感染病毒的時候，這些重復序列就能通過一種核酸酶靶向侵入的互補DNA，并摧毀它。
2013年幾個研究組就利用了這一系統編輯真核生物基因，隨后看到在不少應用中CRISPRs迅速崛起，多個不同物種都實現了基因組中基因刪除和插入，激活或抑制基因轉錄。但是隨著這一系統越來越受歡迎，關于其特異性和有效性的質疑也越來越多。
如何提高導向RNA（gRNA）的特異性是一大問題，這種RNA能將Cas9核酸酶帶領到基因組目標位置，Nature Biotechnology雜志建議切斷gRNAs（Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題），減少脫靶問題，而且不影響靶標活性，而另外一個研究組則建議更長一些的gRNAs。
這明顯是有些自相矛盾的建議，前者的研究人員指出只是簡單截短了gRNA靶標區域的長度，結果發現在之前檢測到的脫靶位點，脫靶突變都大幅減少，與全長gRNA相比，一些位點的突變頻率甚至減少了5，000倍以上。重要的是在靶向它們的預定目標DNA時，這些縮短了的gRNA（稱為tru-gRNA）與全長gRNA同樣有效。而后者則發現選擇合適的靶標序列，優化gRNA和Cas9，就能避免或者減少脫靶突變的出現。另外一個問題是如何篩選脫靶，以及中對于研究的影響有多少。可以驗證gRNAs錯配候選位點的方法也許會錯失一些關鍵的剪切位點，而且全基因組測序也不是非常有效，目前我們需要一種敏感且無偏差的方法，來標記Cas9靶標位點，并令它們能在整個基因組中被識別出來。
其它的令這一系統特異性更強的方法還有，用配對替換切口酶（nickases）替換Cas9核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將Cas9突變融合到Fok1這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過來自不同物種的Cas9也能增加靶向多個位點的靈活性，進一步改善Cas9-gRNA復合物的傳遞系統，也有助于增加效率。
盡管Cas9潛力，但是這還是一種細菌的蛋白，對于一些應用，尤其是臨床上的應用來說，還需要尋找真核生物核酸酶進行替換。對于植物來說，一些Argonaute核酸酶能通過小RNAs靶向DNA，這也是基因組編輯可以考慮的一個方向。
推薦行情