一站式柱式miRNAout
發(fā)布日期：2013-06-25 瀏覽次數(shù) ：992
一站式柱式miRNAout
產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品是在天澤基因miRNAout (CAT#:70501)基礎(chǔ)上開發(fā)的柱式升級產(chǎn)品，是目前外市場上快速簡單的小RNA分離純化產(chǎn)品。它具有下列特點：
1. 一步法直接分離純化小RNA，比兩步法（先分離總RNA和再純化其中的小RNA）和PAGE電泳回收法更簡單。得到的小RNA長度大部分在200 nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。
2. 柱式操作，比miRNAout更加簡單快捷，整個過程只需要十多分鐘。
3. 適用范圍廣，可以用于動物組織、血液、植物等各種實驗材料。
4. 小RNA純凈，OD260/280一般都在1.9以上。
5. 產(chǎn)率一般為20-40 ug/100 mg動物組織，10-30 ug/100 mg植物組織。
6. 無基因組DNA的污染。
7. 可用于RT-PCR、miRNA標記、microarray等后續(xù)實驗。
規(guī)格及成分 成 份 50次包裝
溶液A 25 mL
溶液B 25 mL
溶液C 50 mL
離心吸附柱 100套
通用洗柱液 50 mL
RNA洗脫液 10 mL
使用手冊 1份
運輸及保存 常溫運輸，4℃保存，有效期一年。
自備試劑 氯仿。
使用方法 由于離心吸附柱的吸附量限制，本產(chǎn)品每次提取只能處理100mg左右的各種組織，可以在1.5 mL塑料離心管中。如果處理樣品量大，請分成很多相當于微量提取的量進行，后再收集在一起。
1. 新鮮配制裂解液。將溶液A和溶液B按1:1的比例混合，然后根據(jù)組織細胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：溶液A和溶液B混合后必須立即使用，不要放置，否則會產(chǎn)生沉淀。
a) 對貼壁細胞：吸盡培養(yǎng)液，在每10平方厘米細胞中加入1 mL新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細胞全部裂解。
b) 對懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，在每1-5×106懸浮細胞中加入1 mL新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL新鮮配制的裂解液的細胞使用量不要超過1×106個細胞。
c) 對新鮮的動物組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入10 mL或15 mL塑料離心管中，每50-100 mg組織加1 mL新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿30秒左右。對肝、脾、胰、腎等細胞分裂十分旺盛的組織（細胞中含大量正在復制的DNA），建議組織的使用量不要超過50 mg/ mL裂解液，否則十分容易產(chǎn)生DNA污染。
d) 對新鮮的植物組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入10 mL或15 mL塑料離心管中，每50-100 mg組織加1 mL新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿30秒左右。
e) 對RNALOCKER保存動物或植物組織：先用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊，放入10 mL或15 mL塑料離心管中，每50-100 mg組織加1 mL新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿30秒左右。
2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個干凈的1.5 mL塑料離心管中，然后加入0.2倍體積的自備氯仿(1 mL裂解物需0.2 ml氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均30秒。
3. 12000-15000 g室溫離心3-5分鐘。
4. 將上清液（約0.6-0.8 mL）轉(zhuǎn)移到一根離心吸附柱中以去除大RNA（標記以跟后面要用的專門吸附小RNA的另一離心吸附柱區(qū)別開來，本試劑盒提供的離心吸附柱之間沒任何區(qū)別，可以隨機選一個做大RNA吸附，另一個做小RNA吸附）。注意：離心后下層有機相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA污染。為保險起見，可以留下100 uL上清液不取。同時吸取上清時緩慢進行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀DNA。
5. 12000-15000 g室溫離心半分鐘，收集管中的穿透液。大RNA及DNA將與離心吸附柱的膜結(jié)合，小RNA將存在于穿透液中。但由于離心吸附柱的zui大吸附能力為40 ug動物RNA，20 ug植物RNA，如果樣品中的大RNA含量高于上面數(shù)值，則穿透液中將同時含有大RNA和小RNA，在此情況下，穿透液需要再次重復上柱以去除大RNA。由于此時離心吸附柱已經(jīng)吸附了大RNA，所以需要預處理（具體步驟見本手冊后的附錄）。
6. 在后得到的不含大RNA的穿透液中加等體積的溶液C，混勻。此時溶液的總體積約1.5 mL。
7. 先轉(zhuǎn)移約0.75mL到一新的離心吸附柱中。注意：不要使用已經(jīng)使用過的、用來吸附大RNA的離心吸附柱。12000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
8. 將上步上柱剩余的樣品轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
9. 加0.7mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000-15000 g室溫離心半分鐘，棄穿透液。
10. 加0.3mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000-15000 g室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000-15000 g室溫離心半分鐘以甩出殘聯(lián)液體。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響miRNA的使用。
12. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free收集管中，加入50-100 uL RNA洗脫液。
13. 12000-15000 g室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為miRNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
附錄：
1. 將結(jié)合有大RNA和DNA的離心吸附柱中加入0.1mL自備的超純水, 12000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集液。
2. 再加0.1mL自備的超純水，重復上步一次。
3. 將第5步的得到、需要進一步去除其中大RNA和DNA污染的穿透液直接上柱，12000-15000 g室溫離心半分鐘，收集穿透液（此穿透液含小RNA）。
4. 如果大RNA已經(jīng)去干凈，可以直接進入第6步；如果大RNA沒有去除干凈，則用本附錄1-2的方法處理離心吸附柱，然后再將此穿透液加入（接本附錄第3步）。一般樣品只需要額外處理一次就可以去除全部的大RNA污染。
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