檢測原理
人白介素6(IL-6) ELISA試劑盒是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒（Enzyme-l
試劑盒組成
酶標板 、標準品、濃縮生物素化抗體 、濃縮酶結合物(ABC)、酶結合物(ABC)稀釋液 、抗體稀釋液 、標準品稀釋液 、樣品稀釋液、濃縮洗滌液(25×) 、顯色劑 A 、顯色劑 B 、終止液
需自備物品
1. 酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片) ；
2. 洗板機（可調注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）；
3. 單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl)；
4. 多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl)；
5. 37℃恒溫箱；
6. 低溫離心機；
7. 純凈水或蒸餾水。
標本收集注意事項
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原、無內毒素試管；
2. 血清和血漿避免使用溶血、高血脂標本；
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除；
4. 標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃冰箱內，避免反復凍融；
5. 可根據標本的實際情況，做適當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數) ；
6. 收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤實驗進程；
7. 收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，口罩，護目鏡等），因為所有標本都具有一定的潛在危險性；
8. 樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。
標本處理
1. 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；
2.血漿：用EDTA，枸櫞酸鈉，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；
3. 組織勻漿：切取組織塊，0.01M PBS中過洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；
4. 細胞培養上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；
5. 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃3-6個月）保存；
注 樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關文獻了解標本內待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。
注意事項
1．試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結；
2．濃縮生物素化抗體、濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底；
3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結晶完全溶解后再配制洗滌液；
4．實驗過程中，凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時候后，會迅速失活；
5．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用；
6．配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑，充分混勻對測試結果尤為重要，好使用微量振蕩器(使用低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻；
7．實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規范操作，并在使用前充分預熱；
8．ELISA實驗中標準品和樣本檢測時建議作復孔；
9．應將未用的酶標板放回原鋁箔袋中，置2-8℃保存；
10．顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
11．超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中；
12．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為450nm和630nm；
13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全；
14．各步驟加樣均應使用加樣器，并經常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣；
15．每次試驗測定的同時做標準曲線，好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數（×n）；
16．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性；
17．以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時, 用帶紙屑的吸水材料應慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發生反應；
18．用終止液終止反應后，請于10分鐘內讀取OD值；
19．進行復孔實驗時，結果計算一定要求平均值；
20．標本溶血可能會有假陽性結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；
21．實驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內，并保持濕度約60%左右；
22．為保證恒溫箱內的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經常校準。以確保實驗溫度保持恒定；
準備工作
1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗；
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 ；
3. 標準品: 加入標準品稀釋液1.0ml至凍干標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻，之后在管身標注①，然后根據需要進行稀釋注意：務必要保證凍干標準品徹底溶解和混勻。
4. 標準品稀釋方法： 取7支潔凈的試劑管，分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧. 每管加入300μl標準品稀釋液。從第①管內取出300μl加入到第②管，混勻后，再從第②管取出300μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。
5. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)，配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備，僅供當日使用；
6. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要用量，用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100)，配置成酶結合物工作液。使用前30分鐘準備，僅供當日使用；
7. TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A x 9份加TMB顯色液B x 1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。
洗滌方法
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350μl，注入與吸出間隔20－30秒。確保機器運用熟練后，再投入實驗中使用；
2. 手工洗板：每孔加洗滌液350μl，靜置30秒后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干。手工洗板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現跳孔的現象。
操作步驟
1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內封存于2-8℃；
2. 預留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設）；
3. 分別將標本或不同濃度的標準品（0ng/mL孔加標準品稀釋液）加入相應孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分鐘；
4. 提前30分鐘制備生物素化抗體工作液；
5. 洗板2次；
6. 加入生物素化抗體工作液(100μl/孔)，37℃孵箱孵育60分鐘；
7. 提前30分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置；
8. 洗板3次；
9. 除空白孔外，加入酶結合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘；
10. 洗板5次；
11.加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當標準曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘；
12.加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測量OD（450nm）值(10分鐘內)。
結果判斷
1．每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相交于Y軸）；
2．手工繪制標準曲線：以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3進行結果計算；
3．若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
操作程序總結
1.準備試劑，樣品和標準品；
2.加入準備好的樣品和標準品，37℃反應90分鐘 ；
3.洗板2次，加入生物素化抗體工作液，37℃反應60分鐘；
4.洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應30分鐘；
5.洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應；
6.加入TMB終止液；
7.10分鐘之內酶標儀測OD值；
8.計算標本待測因子含量。
