產(chǎn)品名稱：神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法)
規(guī)格：50T
分類：神經(jīng)染色
儲(chǔ)存條件：4℃,避光,6個(gè)月
用途：神經(jīng)HRP示蹤DAB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色。
注意事項(xiàng)：主要由DAB孵育液、雙氧水、乙酸鈉緩沖液等組成,染色后呈棕色。
簡(jiǎn)介：上個(gè)世紀(jì)70年代，Kristensopn和Olsson報(bào)道了HRP可經(jīng)神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，經(jīng)組織化學(xué)方法可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而開(kāi)發(fā)出HRP追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即為HRP法。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根過(guò)氧化物酶的常用底物。在辣根過(guò)氧化物酶的催化下，DAB會(huì)產(chǎn)生棕色沉淀，該棕色沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈棕色，可在顯微鏡下觀察。神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法)是動(dòng)物經(jīng)麻醉、注入HRP后，游離或絡(luò)合型的HRP不氧化劑反應(yīng)生成絡(luò)合物，該絡(luò)合物氧化供氫的DAB顯色劑，呈棕色，在顯微鏡下清晰可見(jiàn)。該顯色液僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考)：
(一)、準(zhǔn)備工作
1、動(dòng)物麻醉：多用(3.5%)戊巴bi妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為0.25-0.35ml/100g。
2、導(dǎo)入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的注射涂抹等法。
3、確定動(dòng)物存活期。
4、動(dòng)物灌注：麻醉后，經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理鹽水或PBS快速灌注。隨后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時(shí)間控制在30-40min。后用10%蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。
5、取材：取組織置于20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。
(二)、顯色反應(yīng)
1、配制DAB孵育液：取適量的DABassaybuffer和DAB顯色液，按DABassaybuffer：DAB顯色液=39:1的比例混合，即為DAB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制DAB顯色工作液：取適量的DAB孵育液和DAB增強(qiáng)劑，按DAB孵育液：DAB增強(qiáng)劑=2000～8000：1的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時(shí)間摸索確定)，即為DAB顯色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×DABWashbuffer：取適量的DABWashbuffer(20×)，按DABWashbuffer：蒸餾水=1:19的比例混合，即為1×DABWashbuffer。室溫保存，6月有效。
4、切片用蒸餾水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlDAB孵育液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動(dòng)。
6、切片入10mlDAB顯色工作液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動(dòng)。
7、漂洗：取10ml左右的1×DABWashbuffer漂洗切片2-3次，每次5min。
8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。
9、脫水、透明步驟按如下操作：①蒸餾水10s②70%乙醇10s③95%乙醇10s④乙醇2次，每次10s⑤二甲苯2次，每次2～5min。
10、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察棕色反應(yīng)。
注意事項(xiàng)：
1.如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀,表明DAB底物反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈。
2.所用器皿必須潔凈,避免含有氧化劑或還原劑,否則會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
3.DAB顯色液避免反復(fù)凍融,以免顯色效率下降。
4.DAB增強(qiáng)劑注意密閉保存,否則顯色效率下降。
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