產品名稱：神經HRP示蹤顯色液(TMB法)
規格：50T
保存： RT 避光，有效期6個月。
產品簡介：
上個世紀70年代，Kristensopn和Olsson報道了HRP可神經末梢攝取，經軸漿逆行運輸至神經元胞體，經組織化學方法可顯示出神經元的輪廓，從而開發出HRP追蹤神經元示蹤技術，即為HRP法。3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)是非常優越的酶免試驗顯色劑，能溶解于多種有機溶劑和雙蒸水中，為穩定的無色溶液，與適量過氧化脲或雙氧水與緩沖液混勻后，與過氧化物酶作用產生清晰的藍色產物，極易觀察，在辣根過氧化物酶的催化下,TMB會產生藍色沉淀，該沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈藍色，可在顯微鏡下觀察。神經HRP示蹤顯色液(TMB法)是動物經麻醉、注入HRP后，游離或絡合型的HRP與氧化劑反應生成絡合物，該絡合物氧化供氫的TMB顯色劑，呈藍色，在顯微鏡下清晰可見，該檢測法較DAB法靈敏。該顯色液僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考)：
(一)、準備工作
1、動物麻醉：多用(3.5%)戊巴bi妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為0.25-0.35ml/100g。
2、導入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經系統的注射涂抹等法。
3、確定動物存活期。
4、動物灌注：麻醉后，經左心室升主動脈插管行心內灌注固定。先用生理鹽水或PBS快速灌注。隨后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時間控制在30-40min。后用10%蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。
5、取材：取組織置于20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。
(二)、顯色反應
1、配制TMB孵育液：取適量的TMBassaybuffer和TMB顯色液，按TMBassaybuffer：TMB顯色液=39:1的比例混合，即為TMB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制TMB顯色工作液：取適量的TMB孵育液和TMB增強劑，按TMB孵育液：TMB增強劑=2000～8000：1的比例混合(具體比例應根據具體時間摸索確定)，即為TMB顯色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×TMBWashbuffer：取適量的TMBWashbuffer(20×)，按TMBWashbuffer：蒸餾水=1:19的比例混合，即為1×TMBWashbuffer。室溫保存，6月有效。
4、切片用蒸餾水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlTMB孵育液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。
(二)顯色反應
1、配制TMB孵育液：取適量的TMBAssaybuffer和TMB顯色液，按TMBAssaybuffer：TMB顯色液=39:1的比例混合，即為TMB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制TMB顯色工作液：取適量的TMB孵育液和TMB增強劑，按TMB孵育液：TMB增強劑=2000～8000：1的比例混合(具體比例應根據具體時間摸索確定)，即為TMB顯色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×TMBWashbuffer：取適量的TMBWashbuffer(20×)，按TMBWashbuffer：蒸餾水=1:19的比例混合，即為1×TMBWashbuffer，室溫保存，6月有效。
4、切片用蒸餾水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlTMB孵育液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。
6、切片入10mlTMB顯色工作液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。
7、漂洗：取10ml左右的1×TMBWashbuffer漂洗切片2~3次，每次5min。
8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。
9、脫水、透明步驟按如下操作：
①蒸餾水10s
②70%乙醇10s；
③95%乙醇10s；
④乙醇2次，每次10s；
⑤二甲苯2次，每次2～5min。
10、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察藍色反應。
注意事項：
1、如果出現高的反應背景或沉淀，表明TMB底物反應過于強烈。
2、所用器皿必須潔凈，避免含有氧化劑或還原劑，否則會產生非特異性反應。
3、TMB顯色液避免反復凍融，以免顯色效率下降。
4、TMB增強劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。
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