DNA快速連接試劑盒說明書
產品編號：BTN70602
規格：30T/100T
產品及特點：
DNA 連接反應通過T4 連接酶催化雙鏈DNA 的3'-OH 和5'-P 形成磷酸二脂鍵而將DNA共價連接在一起。被連接的DNA末端可以是粘末端（例如限制性切割EcoR I 產生的末端），也可以是平末端（限制性切割Sma I產生的末端）。Pheiffer 等人發現PEG 可以促進T4 DNA 連接酶催化的連接反應[NAR, 11, 7853-7871, 1983]，連接反應只需十分鐘即可完成。
本產品就是根據這一原理設計，其特點如下：
1. 超快，整個連接反應只需要室溫5 分鐘左右，反應液可以直接用于轉化實驗。
2. ，溶液配方經過優化，每ug 插入DNA 連接轉化得到的重組子可達107左右。
3. 既可用于平末端連接，也可用于粘末端連接，包括PCR 產物與T 載體的連接。
4. 簡單，客戶只需要提供載體和插入片段即可。
格及成分：
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成分 |
30T |
100T |
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溶液A |
150μl |
500μl |
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溶液B |
30μl |
100μl |
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說明書 |
1份 |
1份 |
保存條件：
低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一: 連接反應
1. 在無菌的離心管中嚴格按下表順序加入列各成分（以10 μL 體系為例）:
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成分 |
陰性對照管 |
樣品管 |
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溶液A |
5μl |
5μl |
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插入片段（自備） |
- |
0.2-0.5μg(注) |
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載體（自備） |
50ng |
50ng |
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無菌水 |
補水到9μL |
補水到9μL |
注: 插入DNA 片段的摩爾數zui好是載體的3-10 倍，如果載體長度為3000bp，則所需插入DNA 片段折合成重量(ng) ＝ (插入DNA片段bp 數×50 ng×N)÷3000 bp。N就是自己選定的插入DNA片段與載體的摩爾比。
2. zui后在每管中加入1 μL 溶液B，輕柔吹打混合均勻后用微量離心機將液體全部甩到管底。
3. 室溫放置至少5 分鐘，zui長可以放置過夜。
4. 70℃保溫10 分鐘。此步可以滅活有關的酶，否則轉化效率有所降低。
5. 根據使用的轉化方法，每管各取適量用于轉化實驗，余下的放置在-20℃保存。
二：細菌轉化及篩選（僅供參考，本產品不提供相關試劑）
6. 將100 μL 轉化效率在1×108 cfu/μg 以上的感受態細胞于冰上解凍。
7. 取5-10 μL 連接產物加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻。
8. 在冰上放置30 分鐘。
9. 將離心管放42℃熱休克90 秒，然后快速將其轉移到冰浴中放置1～2分鐘。
10. 每管中加900 μL LB 培養基，37℃振蕩培養1 小時復蘇細胞。
11. 將100 μL 復蘇涂布到含Amp 的LB 瓊脂平板上（根據載體情況也可能需要加上X-gal 和IPTG）。
12. 室溫4,000 rpm 離心剩余的900 μL 復蘇細胞5 分鐘，棄去800μL上清，用剩余100 μL 培養基重懸細胞并涂布到含Amp 的LB 瓊脂平板上（可加X-gal、IPTG）。
13. 將平板置于室溫直至液體被吸收。此步非常重要，否則培養板將在37℃排除水分，細菌將隨水在培養基上到處游動，不能形成單個菌落。
14. 倒置平皿，于37℃培養，12~16 小時后可出現菌落。一般情況下陽性對照組會有上千個菌落（100 μL 轉化液產生的菌落數×10），自聯對照只有少數幾個菌落，樣品組的菌落數取決于PCR 回收片段的質量。
15. 按常規方法篩選重組子。
