試劑盒使用說明書
廈門慧嘉生物科技有限公司
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿，細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中蛋白激酶C（PKC）的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠蛋白激酶C（PKC）水平。用純化的大鼠蛋白激酶C（PKC）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入蛋白激酶C（PKC），再與HRP標(biāo)記的蛋白激酶C（PKC）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白激酶C（PKC）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠蛋白激酶C（PKC）濃度。
試劑盒組成：
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試劑盒組成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片（48） |
2片（96） |
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密封袋 |
1個(gè) |
1個(gè) |
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酶標(biāo)包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
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標(biāo)準(zhǔn)品：180nmol/L |
0.5ml×1瓶 |
0.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
1.5ml×1瓶 |
1.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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酶標(biāo)試劑 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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樣品稀釋液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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終止液 |
3ml×1瓶 |
6ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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濃縮洗滌液 |
（20ml×20倍）×1瓶 |
（20ml×30倍）×1瓶 |
2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為120nmol/L，80nmol/L ，40nmol/L，20nmol/L，10nmol/L）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計(jì)算時(shí)請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%
檢測范圍：
15.6 pg/ml-1000 pg/ml
靈敏度：
3.9 pg/ml
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
