NCI-H460細胞素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。...

素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。

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細胞培養的基本方法

一節 培養細胞的細胞生物學

一、基本概念通常，體外培養的生物成分無外乎兩種結構形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊；

其二是將生物組織分散后制成的單個細胞，一般稱為分離的細胞(isolated cell)或者分散的細胞(dissociated cell)。

分散的過程通常在培養液或平衡鹽溶液中進行，分散的細胞被懸浮于培養液或平衡鹽溶液中。

單個細胞分散存在于培養液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細胞懸液(cell suspension)。

狹義的細胞培養(cell culture)主要是指分離（散）細胞培養，廣義的細胞培養的概念還包括單（個）細胞培養(single cell culture)。一種是群體培養（mass culture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養（clonal culture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

現今，用于疫苗生產的細胞基本有3類，即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經過幾十年的研究和發展，目前我國已經擁有了可以進行大規模疫苗生產的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產技術，用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%，可持續地進行培養，不含任何污染因子。通常使用199培養基添加5%胎牛血清進行培養。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。NCI-H460細胞

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二、體外培養細胞的分型

（一）貼附型：大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：

1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。培養中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。

3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。

4、多型細胞型：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。NCI-H460細胞

三、培養細胞的生長和增殖過程:體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞在體外的生存也不是的，存在著一個發展過程。所有這一切，使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。

（一）培養細胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發生改變。正常細胞培養時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經歷以下三個階段：

1、原代培養（Primary Culture）期：也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到一次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。

2、傳代期：初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續時間長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。

3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，后衰退凋亡。

在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續細胞系（Continuous Cell Line）。細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養細胞一代生存期 所有體外培養細胞，包括初代培養及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀少時要快）。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快，培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。

所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間，這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。

細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：

1、潛伏期（Latent Phase）：細胞接種培養后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經過前述延展過程變成性細胞，還要經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。

2、指數增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細胞增值旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%。pH和培養液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力的時期，因此是進行各種實驗的和主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。

3、停滯期（Stagnate Phase）：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在實驗中應特別注意的。

四、原代培養:即一次培養，是指將培養物放置在體外生長環境中持續培養，中途不分割培養物的培養過程。有幾方面含義：

培養物一經接種到培養器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；

原代培養中的“代”并非細胞的“代”數，因為培養過程中細胞經多次分裂已經產生多代子細胞；

原代培養過程中不分割培養物不等于不更換培養液，也不等于不更換培養器皿。

正常細胞培養的世代數有限，只有癌細胞和發生轉化的細胞才能生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。目前上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養而成。此細胞系一直延用至今。

原代培養的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會出現停滯，大部分細胞衰老死亡。但是有少數的細胞能夠度過“危機”而繼續傳下去，這些存活的細胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質沒有發生改變,在培養過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現“危機”，不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質發生了改變，并且帶有癌變的特點，有可能在培養條件下制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。

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