抗體的制備技術指導
發布時間：2024-01-29瀏覽次數：805返回列表
抗體（antibody），是一種由漿細胞（效應B細胞）分泌,（免疫球蛋白不僅僅只是抗體），被免疫系統用來鑒別與中和外來物質如細菌、病毒等的大型Y形蛋白質，僅被發現存在于脊椎動物的血液等體液中，及其B細胞的細胞膜表面。抗體能識別特定外來物的一個*特征，該外來目標被稱為抗原。
一、抗體制備的基本原則：
抗體制備為重要的兩個原則：適量原則和時間原則。
1.適量原則:根據抗原可獲取的難易程度和實際實驗抗體需求量來決定制備抗體的量，小鼠一個免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高純度抗原獲取的成本都比較高。對于科研來說，能選擇小動物就不要選擇大動物，小動物的抗體產量足以滿足需求；鑒于動物本身個體的差異性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，這樣可以有效避免動物個體差異或動物意外死亡所造的時間成本浪費。
普通的大分子蛋白，通過分子克隆構建載體并在大腸桿菌中進行誘導表達獲得重組蛋白，純化鑒定后可直接作為免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶聯載體對該分子進行改造才能使其成為具有免疫原性的抗原，常見偶聯載體如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫動物
常用于制備抗血清的動物有豚鼠、家兔、雞、大小鼠等，大量生產時需要用到狗、綿羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、綿羊、山羊可采用靜動脈采血，家兔、豚鼠、大鼠、雞可采用心臟采血，家兔、山羊、綿羊可采用靜脈采血。
4. 免疫血清的純化與鑒定
得到的抗血清需要進一步的純化，利用偶聯了抗原的親和柱進行層析，具有高效，特異性強，純度高的特定。接著要鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質量、純度以及特異性。
5. 免疫血清的保存
建議將抗體分裝后進行保存。抗體一般比較穩定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存約5年而不會影響效價，而真空干燥保存時間可以久。保存前需經除菌并添加防腐劑。
抗體制備出來之后,需要進一步純化得到純的多抗或單抗,既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結果的影響。常規用于純化的材料是腹水和細胞培養上清,而通常經過免疫制備的抗體大多數是IgG的各種亞型,以及少數是IgM,二者電泳條帶分步大致如下:
三、抗體操作注意事項:
每次試驗前應列出詳細試驗計劃，其中包含試驗意圖、擬用方法、所用一抗和二抗的品種和效價、預施行的操作流程計劃以及預期試驗結果等。試驗分組編號用玻璃筆標記在玻片上，對每一抗體均應配以陽性和陰性對照。關于抗體的操作過程要素：
1．抗體分裝購人的濃縮型抗體，為防止重復凍融而失效，一般需要分裝在多個安瓿中，依據需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支現用，其余應立即放置低溫冰箱內貯存(-20℃以下)。用時取一支。以免長期保存在4℃冰箱內失效。
2．無菌與消毒保持使用中的抗體無菌是困難的，但是與抗體接觸的東西如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等通過消毒，盡量削減污染的時機．不然抗體極易污染細菌與真菌，然后敏捷發生渾濁沉積而失效。
3．抗體稀釋一般按其作業濃度稀釋，如1：100、1：1000等，然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內．盡量在1—2個月內用完，而不 要放在0℃以下。不然抗體會很快結冰，重復凍融可使抗體效價急劇下降。關于抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時，參加少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等，以免在切片上效果時間超過10小時而生真菌。
一、抗體制備的基本原則：
抗體制備為重要的兩個原則：適量原則和時間原則。
1.適量原則:根據抗原可獲取的難易程度和實際實驗抗體需求量來決定制備抗體的量，小鼠一個免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高純度抗原獲取的成本都比較高。對于科研來說，能選擇小動物就不要選擇大動物，小動物的抗體產量足以滿足需求；鑒于動物本身個體的差異性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，這樣可以有效避免動物個體差異或動物意外死亡所造的時間成本浪費。
2.時間原則:主要是為了解決抗體需求急迫性問題，解決實驗應急問題（畢業論文或者文章修回補充數據或實驗設計方案變等應急問題），對于免疫原性較好、純度較高的抗原，可以使用抗體快速制備方案；目前，商業化抗體制備公司推出快速抗體制備服務，主要依賴于水溶性快速佐劑。
二、抗體的制備過程：
1. 免疫原的制備普通的大分子蛋白，通過分子克隆構建載體并在大腸桿菌中進行誘導表達獲得重組蛋白，純化鑒定后可直接作為免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶聯載體對該分子進行改造才能使其成為具有免疫原性的抗原，常見偶聯載體如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫動物
常用于制備抗血清的動物有豚鼠、家兔、雞、大小鼠等，大量生產時需要用到狗、綿羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、綿羊、山羊可采用靜動脈采血，家兔、豚鼠、大鼠、雞可采用心臟采血，家兔、山羊、綿羊可采用靜脈采血。
4. 免疫血清的純化與鑒定
得到的抗血清需要進一步的純化，利用偶聯了抗原的親和柱進行層析，具有高效，特異性強，純度高的特定。接著要鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質量、純度以及特異性。
5. 免疫血清的保存
建議將抗體分裝后進行保存。抗體一般比較穩定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存約5年而不會影響效價，而真空干燥保存時間可以久。保存前需經除菌并添加防腐劑。
抗體制備出來之后,需要進一步純化得到純的多抗或單抗,既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結果的影響。常規用于純化的材料是腹水和細胞培養上清,而通常經過免疫制備的抗體大多數是IgG的各種亞型,以及少數是IgM,二者電泳條帶分步大致如下:
三、抗體操作注意事項:
每次試驗前應列出詳細試驗計劃，其中包含試驗意圖、擬用方法、所用一抗和二抗的品種和效價、預施行的操作流程計劃以及預期試驗結果等。試驗分組編號用玻璃筆標記在玻片上，對每一抗體均應配以陽性和陰性對照。關于抗體的操作過程要素：
1．抗體分裝購人的濃縮型抗體，為防止重復凍融而失效，一般需要分裝在多個安瓿中，依據需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支現用，其余應立即放置低溫冰箱內貯存(-20℃以下)。用時取一支。以免長期保存在4℃冰箱內失效。
2．無菌與消毒保持使用中的抗體無菌是困難的，但是與抗體接觸的東西如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等通過消毒，盡量削減污染的時機．不然抗體極易污染細菌與真菌，然后敏捷發生渾濁沉積而失效。
3．抗體稀釋一般按其作業濃度稀釋，如1：100、1：1000等，然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內．盡量在1—2個月內用完，而不 要放在0℃以下。不然抗體會很快結冰，重復凍融可使抗體效價急劇下降。關于抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時，參加少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等，以免在切片上效果時間超過10小時而生真菌。
