研究發(fā)現(xiàn)RNA剪接基因編輯的新方法
發(fā)布時間:2018-11-23瀏覽次數(shù):914返回列表
近日,學術(shù)期刊《分子細胞》在線發(fā)表了科學院上海生命科學研究院(營養(yǎng)與健康研究院)常興研究組題為Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase 的zui新研究成果。證明可以利用TAM (Targeted-AID induced mutagenesis)基因編輯,靶向DNA上的RNA剪接順式元件,調(diào)控RNA剪接,用于研究RNA可變剪接的功能,以及用于人類遺傳疾病的治療。
真核細胞中,RNA剪接是基因表達的重要環(huán)節(jié)。據(jù)估計,超過75%的人類基因具有一種以上的mRNA剪接方式(可變剪接),其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質(zhì)。但相對于基因功能而言,對于可變剪接的生理功能,認識還非常有限,原因主要在于調(diào)控內(nèi)源RNA剪接的實驗手段非常有限。RNA剪接的異常也是許多疾病的直接誘因,估計35~50%的人類疾病由基因剪接異常造成。因此,無論是從學術(shù)研究或是臨床應(yīng)用的角度,都亟需開發(fā)出調(diào)控RNA剪接的基因編輯新方法。
常興研究組過去開發(fā)TAM (Targeted AID-induced mutagenesis),也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脫氨酶AID,并且發(fā)現(xiàn)它具有兩個特點。先,可以在sgRNA靶向的DNA上,將C/G堿基隨機向其它堿基突變,可以用于分析腫瘤耐藥性突變及誘導蛋白體外進化等;其次,在偶聯(lián)UNG抑制劑UGI后,可以在將sgRNA靶向區(qū)域中一個小窗口內(nèi)(5-6個堿基)的C向T突變 (Nature Methods, 2016)。
在這一新研究中,博士研究生袁娟娟和馬云青先注意到,98%以上的內(nèi)含子有保守的GU(內(nèi)含子開始)和AG(內(nèi)含子末尾)序列,推測如果可以精que地將G突變成A,可以特異性阻斷外顯子識別,調(diào)控內(nèi)源性mRNA的剪切。通過這一策略,利用TAM誘導剪接位點DNA上G>A突變,就可以誘導可變外顯子(alternative exon)及組成性外顯子(co
zui后,研究人員探索了利用TAM修復杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)的可行性。DMD是一種致命的遺傳疾病(發(fā)病率男性中1/4000)。其發(fā)病原因在于,遺傳突變造成Dystrophin蛋白的完全缺失,引發(fā)肌肉萎縮和癱瘓,zui終造成心臟或肺功能的衰竭。如果通過外顯子跳讀,能產(chǎn)生內(nèi)部截短的Dystrophin蛋白,可以達到對DMD的治療效果。因此研究人員構(gòu)建了DMD病人來源的誘導型多能干細胞,此病人因為外顯子刪除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通過在剪接位點誘導G>A的突變,研究人員實現(xiàn)了目標外顯子的完全跳讀,在所有表達TAM的細胞中恢復了Dystrophin的蛋白表達,修復了心肌細胞的缺陷。






