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PCR熱循環(huán)儀半定量RT-PCR的方法步驟
發(fā)布時間：2013-11-27瀏覽次數(shù)：1782返回列表
以前用的PCR儀是從離心官底部加熱的，不加入石蠟油的話，本來微量的溶液就會因為水的揮發(fā)而導致體系濃度增高，難以擴增成功。
現(xiàn)在的PCR儀改良了，都是從離心管蓋上邊加熱的，解決了那個麻煩。你可以打開儀器看看的。
過去不用熱循環(huán)儀是需要在所有反應試劑比如：dNTP，MgCl2，Prime等加完后，后在表面加入一層油的，而現(xiàn)在熱循環(huán)儀中不再需要加入，請教長期從事PCR的前輩。
半定量RT-PCR的方法步驟
1.原位PCR步驟
1）預處理：
a.切片常規(guī)脫蠟；
b.2mol/L HCl處理10min；
c.5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃10min；
d.Nase消化組織37℃ 30min；
e.梯度酒精脫水，室溫干燥。
2.原位擴增：
a.切片滴加特異性序列引物30μLPCR擴增反應液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊；
b.PCR熱循環(huán)：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30個循環(huán)，72℃延伸10min；
c.氯仿洗去蓋玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脫水，干燥。
