探針法實時PCR原理

發布時間：2013-08-12瀏覽次數：1374返回列表

實時熒光定覺PCR技術是指在PCR反應體系中加人熒光基團，利用熒光信號積累，實時監測整個PCR過程，后通過標準曲線對模板進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR儀常用的檢測模式有TaqMan/TaqMan MGB探針法和SYBR Green I熒光染料法。

TaqMan技術要點是在普通PCR原有的一對特異性引物的基礎上增加了一條特異性的熒光雙標記探針.該探針同樣與核酸特異性結合.且結合部位位于引物結合區域的中間.探針的5'端和3'端分別標記不同的熒光素，如5'端標記FAM熒光素，它發出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱為報告熒光基團;3'端一般標記TAMRA熒光素，它在近距離內能吸收5'端報告熒光基團發出的熒光信號，稱為淬滅熒光墓團.當PCR反應在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結合，探針位于引物之間。此時探針5'端報告熒光基團發出的熒光信號被3'端的淬滅熒光基團吸收，儀器檢測不到熒光信號。當PCR反應進行到延伸階段時.Taq酶在引物的引導下，以四種核昔酸為底物，根據堿基配對的原則.沿著模板鏈合成新鏈。當鏈的延伸進行到探針結合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續.此時的Taq酶發揮它的5'-3'外切核酸酶的功能，將探針切成單核昔酸，消除阻礙，將鏈延伸過程進行到底，合成新鏈，而被水解的探針.其5'端和3'端的熒光素此時均游離于溶液中，5'端標熒光素發出的熒光信號不再被3'端的淬滅熒光基團吸收，熒光信號即被儀器接收.PCR進行一個循環，合成了多少條新鏈就水解了多少條探針，釋放了相應數目的熒光基團，熒光信號的強度與PCR反應產物的量呈對應關系。隨著PCR過程的進行.重復上述過程, PCR產物呈指數形式增長，熒光信號也相應增長(圖5-3).
與上述TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針有兩個主要不同:一是探針3'端標記了自身不發光的淬滅熒光分子，以取代常規可發光的TAMRA熒光素標記。這使熒光本底降低.熒光光分辨率得以大大改善。二是探針3'端另結合T MGB(minor groove binder)結合物，大大增加了探針的雜交穩定性，使結果、分辨率高。
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