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熒光定量PCR儀的原理
發布時間：2021-06-25瀏覽次數：2262返回列表
熒光定量PCR(Fluorogenic Quantitative PCR，簡稱FQ-PCR)技術融匯PCR和DNA探針雜交技術的優點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化,根據PCR反應酶動力學特點,獲得DNA模塊的準確定量結果。該技術整個實驗過程均在完全閉管的狀態下進行，無需PCR后處理和冗長的電泳檢測，解決了常規PCR實驗不能定量分析及擴增產物污染而導致的假陽性，操作繁復等問題，成為常規PCR的新換代技術，是目前的PCR技術。
生物學基礎
按PCR方式進行的體外基因擴增。
酶學基礎
Taq酶的 5'→3' 外切核酸酶活性，可以在鏈延伸過程中實現鏈替換，并將被替換的單鏈切斷。
熒光化學基礎
反應體系中，不僅有兩條普通的引物，還有一條熒光標記探針。這條探針的5'端和3'端分別標記了熒光報告基因(R)和熒光淬滅基團(Q)，當這條探針保持完整時，一旦探針被切斷,淬滅作用消失,R基團的熒光信號就可以被測定。連續檢測熒光的強度與待測的DNA濃度呈正比。
FQ-PCR 反應的實現
熒光標記探針結合在PCR擴增區的中間。PCR反應開始后，隨著鏈的延伸，Taq酶將熒光探針切斷,釋放出R基團的熒光信號。被釋放的游離R基團的熒光信號強弱與PCR產物數量成正比關系，測量出前者就可以算出后者。
FQ-PCR 技術指標
定量范圍：0~1010/ml樣品
定量準確度：±
熒光5'核酸酶化學
近展開了一項，關于食品安全的大檢查。俗話說民以食為天，食品安全關乎人的生命安全。從前幾年的三聚氰胺到后來的蘇丹紅，又有問題奶等很多的食品安全問題的出現。現在人的生病率高了，很大一部分和飲食是有關系的。
根據預測到2025年人口將達到80億，面對有限的耕地資源，糧食問題日益突出。轉基因作物不僅產量高，品質優良而且抵御災害的能力強，一度被各國大力推崇，甚至被譽為第二次“綠色革命”，但是轉基因作為在食品安全方面的爭論一直不斷，再加之各國政府對轉基因作物采取謹慎的態度，要求對其進行必要檢測需檢測之后才能入關。熒光定量 PCR 方法是外進行轉基因成分含量檢測的常用方法，已經用于基因大豆、玉米等的檢測中。我國針對這一情況也出臺了相應的政策，例如中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SNT 1204-2003中要求利用實時熒光PCR對 植物及其加工產品中轉基因成分進行定性檢驗.
那么我們怎么樣在食品的源頭來解決這些問題的出現呢？
熒光定量PCR技術檢測準確，快速，重復性高在食品安全領域發揮重要作用。目前已經應用于食源性致病病毒、 食品過敏源 、轉基因食品、 乳品等檢測。
在食源性致病病毒檢測中，長期以來采用細菌培養法但是這種方法檢測周期長，靈敏度低，操作復雜，熒光定量PCR技術動態范圍寬，靈敏度高，檢測速度快（40-60 min），已在副溶血性弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和和阪崎腸桿菌等食源性細菌檢測中越來越重要。熒光PCR對2084個感染性腹瀉標本的檢測，其中培養法陽性檢出率為45.2%而熒光PCR為90.1%。再如我國出入境檢驗檢疫行業標準SNT 1870-2007中規定對食品中致病菌檢測方法使用熒光PCR方法，SN/T 1632.3-2005中要求使用熒光PCR方法檢測奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法。
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