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非洲豬瘟檢測配套儀器的檢測程序
發(fā)布時間：2019-04-23瀏覽次數(shù)：2459返回列表
非洲豬瘟病毒雖然在環(huán)境中比較穩(wěn)定，但在豬肉烹煮處理過程中較易失活，70℃-75℃加熱30分鐘以上，病毒就會被殺滅，也就是說我們?nèi)粘Ｅ腼冞^程中只要把豬肉熟透(包括中間部位溫度至少達到70℃以上)，即使有病毒也會很快失去感染力并喪失活性。今天我們主要介紹非洲豬瘟檢測配套儀器的檢測程序。
一、實驗材料
ASF的易感動物，主要為家豬、野豬和蜱，通常采集的樣品為家豬、野豬的血液樣品、組織樣品以及蜱三類。田間采集的樣品通常需要經(jīng)過簡單的預處理，才能進行后續(xù)的檢測、診斷工作。
血清：用于病毒核酸檢測、病毒抗原和抗體檢測。將采好的豬血的注射器或采血管在室溫下傾斜靜止2~4h（防止暴曬），或置于37℃溫箱內(nèi)1h，待大部分血清析出后，取出血清，必要時經(jīng)離心分離血清。（低建議量5ml）。
抗凝全血：用于病毒核酸檢測和病毒抗原檢測。
采血前，在真空采血管或注射器內(nèi)按比例加入抗凝劑。采集血液，輕輕上下顛倒，使血液與抗凝劑充分混勻，防止血液凝固的同時避免溶血。也可以將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，震蕩脫落纖維蛋白。必要時，可加入雙抗以抑制血源性或采血過程中可能出現(xiàn)的細菌污染。
當血樣用于病毒核酸檢測時，一般不用肝素而選用EDTA作為抗凝劑。（低建議量1mL）。
組織樣本：活體采集，采用扁桃體，用于臨床健康動物ASF監(jiān)測。
尸體剖檢ASF發(fā)病動物或死亡動物經(jīng)解剖取材，包括：ASFV靶器官的采集：脾臟、淋巴結、腎臟、扁桃體。
其他病變組織臟器的采集：采集具有明顯病變的肝臟、肺臟、心臟等組織器官，選取部位在病變和健康組織交界處。
腐敗動物尸體的樣品采集：剖檢取股骨，將附著的肌肉和韌帶等全部剔除，采集骨髓。低建議量5克。
蜱的采集：蜱可進行核酸檢測、抗原檢測和蜱的形態(tài)學鑒定，查找豬圈的墻邊、墻縫、木質(zhì)或瓦質(zhì)的屋頂，或挖掘豬圈地面均可能找到蜱，也可查看豬表皮，采集蜱。
1-1樣品保存條件
注：用于病毒分離和病理學檢測的樣品禁止-20℃保存。
二、實驗器材和試劑
1、臺式高速冷凍離心機、組織研磨儀、水浴鍋、計時器、冰箱和移液器等。
2、無菌的剪子、鑷子、鋼珠、2mLEP管、移液器吸頭（10μL,200μL、1000μL）等。
3、其他試劑和耗材主要包括：0.01mol/LPBS（PH7.2）、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。
三、樣品處理程序
1、血清及全血樣品處理
取血清或全血樣品1mL于滅菌EP管里，保存?zhèn)溆?br />
2、組織樣品處理
適用于脾臟等組織樣品和蜱的處理。盡可能減少污染，每取一個組織塊或蜱，用火焰消毒剪鑷等取樣器械，組織塊應分別放入滅菌容器內(nèi)并立即密封，做好標記，注意防止組織間相互污染。
3、組織樣品的處理應在二級生物安全柜中進行，勿使液體濺到生物安全柜中。
4、將0.1-0.2g組織塊放入2mLEP管中，用剪刀剪成碎塊，加1-2mL0.01mol/L PBS（PH7.2）,再加入1-2粒滅菌鋼珠，密封后，表面消毒備用。剩余樣品放回容器內(nèi)，重新密封，表面消毒后保存-70℃冰箱。
5、組織樣品的破碎可以利用組織研磨儀在生物安全柜外操作，將樣品制成組織懸液。
四、病毒滅活
病毒的滅活處理應在二級生物安全柜中進行，將處理好的血清、全血或者研磨破碎后的組織樣品連同EP管放入60℃水浴中，放置30min滅活。
五、使用后儀器處理
剪刀、鑷子等均應放入消毒缸進行消毒，放入鐵飯盒內(nèi)，并裝入密封袋內(nèi)進行高壓滅菌處理。裝有組織樣品保存液的容器和盛有組織塊的離心管應密封管口，表面消毒后放入密封袋中高壓滅菌。鋼珠、吸頭等廢棄物應用0.8%NaOH浸泡30分鐘消毒后，置密封袋內(nèi)高壓滅菌。消毒殘液應裝入密封容器內(nèi)高壓滅菌處理。
六、注意事項
操作之前要確認生物安全柜和實驗室已進行了徹底的衛(wèi)生消毒處理，防止樣品間交叉感染。
