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非洲豬瘟檢測熒光定量PCR儀操作步驟
發(fā)布時間：2019-03-14瀏覽次數(shù)：8896返回列表
萊普特非洲豬瘟檢測熒光定量PCR儀可用于臨床實(shí)驗(yàn)室中利用熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法對不同基因進(jìn)行拷貝數(shù)的定量分析。多可配置3個熒光檢測通道，標(biāo)配16孔的檢測通量，可通過內(nèi)置觸屏完成所有實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析。小巧的機(jī)身設(shè)計(jì)，可選配外接電池等特點(diǎn)，體積小，重量輕，易于攜帶，輕松滿足外出實(shí)驗(yàn)的需求。功能強(qiáng)大，可用于相對定量，定量，熔解曲線，陰陽性分析等。內(nèi)置7寸高清電容屏PDA，觸屏操作，簡便快捷。16x0.2ml反應(yīng)模塊，兼容八連排管和單管。可選配外接電池，滿足野外環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的需求。可充分滿足用戶對于小通量實(shí)驗(yàn)以及外出實(shí)驗(yàn)的各種需求簡潔直觀的軟件引導(dǎo)，輕松開啟熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。
非洲豬瘟檢測熒光定量PCR儀操作步驟：
1、病毒DNA的提取（使用A盒）
（1）待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號。
（2）每管加入BufferA500mL。
（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200mL，充分混勻，室溫放置10分鐘。
（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，編號。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱，（為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）。
（5）用TH-15高速離心機(jī)設(shè)置13000 r/min室溫離心30秒。
（6）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（7）吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30秒。
（8）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（9）重復(fù)步驟（7），（8）。
（10）13000 r/min空柱離心2分鐘，去除殘留液。
（11）將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入50μL Buffer C，室溫靜置1分鐘，13000 r/min離心30秒，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉腄NA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若需長期保存須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融）。
2、熒光PCR擴(kuò)增（使用B盒）
（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶，室溫融化后，2 000 r/min離心5秒。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n = 樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個PCR管中各分裝20μL。
（2）分別向上述PCR管中加入（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋，500 r/min 離心30秒。
（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
di一階段，預(yù)變性95℃/3分鐘
第二階段，95℃/15秒，52℃/10秒，60℃/35秒共45個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時進(jìn)行。
