PCR擴增儀在選擇PCR擴增儀時要注意哪些參數呢?
發布時間：2018-09-10瀏覽次數：2034返回列表
PCR擴增儀適用于分子生物學、醫學、食品工業、生物技術、環境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領域以聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction , PCR）為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。PCR是一種體外DNA擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。PCR擴增儀在選擇PCR擴增儀時要注意哪些參數呢?以下內容為大家詳細介紹。
PCR原理：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據堿基互補配對原則復制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子拷貝。在體外實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計與模板DNA的5’端結合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制，多次重復“變性解鏈-退火-合成延伸”的循環就可以以幾何級數大量擴增特定的基因。而發現耐熱DNA聚合酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。
從PCR原理可以看出，PCR儀的關鍵是升降溫的步驟。現在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經過不斷改進，今天的PCR已經越來越完善和智能化。
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：
PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀，普通的PCR擴增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等等。
一、溫度控制
對普通PCR儀來說，溫度控制主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。
溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，它直接關系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應而言重要的莫過于溫度控制的準確性，由于PCR是一個幾何級數擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質量。
溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關系到在不同樣品孔進行反應結果的一致性。我們在實驗中發現有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，后的結果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因為過往反復的教訓和認真的思索得出了這樣的結論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是外周的樣品孔情況差，很有可能影響實驗結果-即“位置的邊緣效應”會影響結果的可重復性。正是這種位置效應對定量PCR的結果的影響為明顯。
溫度控制除了度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指針-升降溫的速度。快的升降溫速度，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，能提高PCR反應特異性。因此從本質而言溫控方式就從以前相對穩定耐用的機械式轉向了升降溫快速的半導體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。
作為用戶來說，當然愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內在的穩定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。現在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應管溫控模式（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據探測器直接探測的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態孵育（如連接、 切、去磷酸化等）。反應管溫控模式實際上是一種仿真試管/PCR板的溫控模式，根據探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算器計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來進行控制。一般說來，管溫控為準確，因為管內樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫（30秒或短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應混合物孵育的時間與程序設定的時間會有相當大的差距。而反應管控制的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應管，確保反應混俁物按照程序設定的時間維持預設溫度。
梯度PCR：對于一個PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能"P"出來結果，細微的變化對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題-在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出適合的反應條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化-對于多種聚合酶混合擴增來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。
對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導致在梯度模式下得出的佳條件與標準模式下單獨做的結果出現差異。
二、儀器的功能性和人性化設計
熱蓋：現在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設為105℃，使樣品管頂部的溫度達到105℃左右，蒸發的反應液就不會產生凝集在管蓋上而改變反應體積，這樣用戶就無需再向反應管內加石蠟油，直接減少后繼操作的麻煩。如果是旋轉加壓的熱蓋就要特別小心，因為壓力到達時沒有明顯的提示，用戶需要根據經驗將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應管而影響結果；如果過緊，則會導致反應管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。
樣品基座：PCR反應多在0.2或者0.5的管子中進行，多數PCR儀也配備了不同的可換樣品槽適配不同的樣品管。
軟件：新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實時信息，，記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復雜環境使用。
綜合考慮，一臺PCR擴增儀選購的關鍵還是在于用戶自己的要求，有些功能可能都用不上或很少用，用戶需要仔細斟酌，畢竟是一分錢一分貨。
