知識詳解：細胞培養常見問題及解答

  1. 如何選用特殊細胞系培養基?

  培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

  2. 何時須換培養基?

  視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的換時間，按時換培養基即可。

  3. 可否使用與原先培養條件不同的培養基?

  不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供的培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

  4. 可否使用與原先培養條件不同的血清種類?

  不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

  5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

  6. 培養細胞時應使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?

  一般培養基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統，而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時，則應使用5% CO2 培養細胞。

  7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?

  HBS和EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

  8. 什么是細胞的接種密度?

  依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

  9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?

  一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

  10. 冷凍管應如何解凍?

  取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

  11. 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO?

  除少數特別注明對DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，在解凍之后，應直接放入含有10-15 ml新鮮培養基的培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

  12. 附著性細胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

  一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會。

  13. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速?

  回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

  14. 細胞冷凍培養基的成份為何?

  動物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

  15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?

  冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4℃，避免反復冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。

  16. 冷凍保存細胞的方法?

  冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

  冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

  17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

  冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

  18.培養基中是否須添加抗生素?

  除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

  19. 應如何避免細胞污染?

  細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的**方法。當然，適當添加抗生素也是防止細胞污染的途徑，Invivogen公司就能提供多種細胞抗生素類產品：

  Primocin?——原代細胞抗生素

  Primocin?是專門設計用于保護原代細胞免受微生物污染的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體和真菌均有殺傷作用。Primocin?對原代細胞沒有毒性，因為其作用的靶標只存在于微生物上。其中細菌的靶標為DNA解旋酶和原核細胞核糖體亞基30S和50S;真菌的靶標為麥角固醇(一種只發現于真菌和酵母細胞膜的分子)。Primocin?的推薦使用濃度為100 mg/ml,無需添加青霉素/鏈霉素。

  產品名稱

  規格

  產品編號

  Primocin?

  500 mg (10 x 1 ml)

  ant-pm-1

  1 g (1 x 20 ml)

  ant-pm-2

  Normocin?——細菌、真菌、支原體多效抗生素

  Normocin?具有抗細菌、真菌、支原體三種微生物的作用，其包含兩種成分可通過阻斷DNA復制和蛋白合成來殺滅細菌和支原體。第三種成分通過干擾細胞膜離子交換來清除酵母和真菌。Normocin?推薦使用濃度為100 mg/ml，該濃度對細胞沒有毒性。此外，如果與青霉素/鏈霉素合用，可以增加抗菌譜。

  產品名稱  規格  產品編號

  Normocin?

  500 mg (10 x 1 ml)

  ant-nr-1

  1 g (1 x 20 ml) ant-nr-2

  Fungin?——真菌特異性抗生素

  Fungin?是Pimaricin(匹馬菌素)的可溶性形式，Pimaricin是十九世紀五十年代發現的多烯抗真菌試劑，可通過干擾細胞膜離子交換的方式殺滅酵母、霉菌和真菌。Fungin?十分穩定，在37°C放置6天仍具有活性。與Amphotericin B(兩性霉素B)需要溶于有毒的脫氧膽酸鹽不同，Fungin?是水溶性的，對細胞性，并且不會影響細胞代謝，推薦使用濃度為10 mg/ml - 50 mg/ml。

  產品名稱  規格  產品編號

  Fungin?

  75 mg (5 x 1.5 ml)

  ant-fn-1

  200 mg (1 x 20 ml) ant-fn-2

  20. 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理?

  原則上：直接滅菌后丟棄之。

  當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

  高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

  (1) 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

  (2) 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

  (3) 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。

  (4) 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。

  (5) 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

  (6) 重復步驟4。

  (7) 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。

  21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

  不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

  22. 支原體污染會對細胞培養有何影響?

  支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數，代謝及研究的任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果的數據方有意義。

  23. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理?

  直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染

  Plasmocin?——支原體預防與去除利器

  Plasmocin?是目前全球*受科研工作者歡迎的支原體抗生素之一。其包含大環內酯物及對苯二酚兩種主要成分，可有效作用于支原體復制的蛋白合成階段和DNA復制階段，只需兩周即可清除支原體污染，并且不會影響細胞本身代謝;其特有的轉運載體可以將有效成分轉運到細胞內，故對胞內支原體和胞外游離的支原體都十分有效。此外，低濃度的Plasmocin?對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌也有一定的清除作用。

  Plasmocin? Treatment (ant-mpt)

  用于清除支原體污染，使用濃度為25 ug/ml,2周即可徹底清除支原體。

  Plasmocin? Prophylactic (ant-mpp)

  用于預防支原體污染，定期添加于細胞培養基中，使用濃度為2.5 - 5 ug/ml。

  產品名稱  規格  產品編號

  Plasmocin? treatment

  50 mg (2 x 1 ml)

  ant-mpt

  Plasmocin? prophylactic

  25 mg (10 x 1 ml)

  ant-mpp

  Plasmocure?——強力清除具有Plasmocin?抗性的支原體

  據報道在極少數情況下，有些支原體對Plasmocin? 具有抗性。基于此，InvivoGen又開發了第二款支原體抗生素Plasmocure?。Plasmocure?采用不同于Plasmocin?作用機制的兩種抗生素來殺滅支原體，處理兩周時間即可徹底清除這些頑固支原體。在處理過程中有輕度的細胞毒性，但支原體清除后細胞系可完全恢復。Plasmocure?推薦使用濃度為50 mg/ml。

  產品名稱  規格  產品編號

  Plasmocure?

  100 mg (1 x 1 ml)

  ant-pc

  24. CO2 培養箱的水盤如何保持清潔?

  定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水換之。

  25. 為何培養基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性?

  培養基保存于4℃冰箱中，培養基內的CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而偏暗紅。培養基偏堿的結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2， 以調整pH 值。

  26. 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同?

  不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異。

  27. 購買的細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少的情形?

  研究人員在冷凍細胞的培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再換培養基即可。

  28. 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

  研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80℃太久。

  29. 如何避免沉淀物的產生?

  我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

  (1) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉淀物。

  (2) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

  (3) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

  (4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

  (5) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

  30. L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

  L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

  31. GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

  GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

  GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121℃滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

  32. 什么培養基中可以省去加酚紅?

  酚紅在培養基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，(特別是雌激素)。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，不用加。

  培養基 血清 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒