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Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒樣本要求及實驗操作步驟
發布時間：2023-09-14瀏覽次數：855返回列表
Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒樣本要求及實驗操作步驟
樣本要求：新鮮活檢樣本組織，中性福爾馬林或多聚甲醛，固定時間 12-48h，參照病理技術規范要求取材、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊，蠟塊在常溫條件下保存有效期有 5 年。組織切片厚度為 3-5μm 并黏
附在防脫玻片上，輕拍切片架并用吸水紙吸干組織切片中的水滴，再放入 56-60℃恒溫箱中烘烤 2h 后，從恒溫箱中移出玻片放在溫室下冷卻。如果切片在室溫下(15-28℃)保存，為了良好的重現組織中的抗原分布情況，請于切片制作后 7 天內完成檢測。
Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒
實驗操作步驟(以石蠟切片為例)
儀器、設備：
移液槍、免疫組化筆、水浴鍋、計時器、孵育濕盒、切片架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶等。
操作步驟
1.脫蠟水化。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫中浸泡 15 分鐘，重復三次。去除多余的液體后，依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分鐘，蒸餾水(或自來水)沖洗 5 分鐘。用 PBS 緩沖液(試劑 1，將干粉溶解于 2L 去離子水中)沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
2.抗原修復。將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯(或修復盒)中的耐高溫塑料切片架上，加適量修復液 1× 檸檬酸鈉抗原修復液(試劑 2，將 100×檸檬酸鈉抗原修復液加去離子水稀釋成 1×檸檬酸鈉抗原修復液)，液面要浸過切片組織一定高度，將修復盒置于沸水中煮沸修復 15 分鐘后取出玻片，自然涼至室溫。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
注意：抗原修復時，修復液務必保證切片始終浸泡在液體內，一般情況：修復液的量約為 800mL/1 架。
3.阻斷內源性過氧化物酶。用吸水紙擦干玻片，免疫組化筆在組織周圍畫圈，滴加 50μL 內源性過氧化物酶阻斷劑(試劑 3)到切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育 30 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
4.血清封閉。用吸水紙擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液(試劑 5)，37℃封閉 20 分鐘，以減少非
特異性染色。
5.一抗孵育。用抗體稀釋液(試劑 4)將一抗原液稀釋成工作液，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，滴加適量抗體工作液，置于濕盒 4℃孵育過夜或 37℃孵育 1h-2h。
6.復溫。4℃過夜后從冰箱拿出樣本，在室溫下孵育 15min 復溫(抗體孵育為 4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進入下一步清洗)。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
7.二抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 生物素標記的羊抗兔 IgG(試劑 6)，37℃孵育 20 分鐘，用 PBS
緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
8.三抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 辣根酶標記的鏈酶卵白素孵育(試劑 7)，37℃孵育 20 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
9. 顯色。甩去 PBS 緩沖液，吸水紙擦干切片; 每張切片滴加新鮮配制的 DAB 工作液 50 μL
(試劑 8：試劑 9：試劑 1=1:1:18 比例配置)，孵育 3-5min，光學顯微鏡下觀察染色結果，切勿顯色過深;顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。
10.復染。滴加適量蘇木素染液(試劑 10)復染，孵育 1-5 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘，滴加鹽酸酒精分化液分化 30 秒，自來水沖洗。
11.脫水封片。將玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇，各浸泡 5 分鐘， 再將玻片放入二甲苯中浸泡 15 分鐘，重復三次。玻片取出來稍晾干，用中性樹膠封片。
Ⅱ型膠原蛋白抗體免疫組化試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。
