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古朵分享：溶菌酶的性質(zhì)及制備方法有哪些?
發(fā)布時(shí)間：2023-03-15瀏覽次數(shù)：911返回列表
古朵分享：溶菌酶的性質(zhì)及制備方法有哪些?
溶菌酶(lysozyme)又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解細(xì)菌中黏多糖的堿性酶。溶菌酶主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)合體，使病毒失活。 該酶廣泛存在于人體多種組織中，鳥(niǎo)類(lèi)和家禽的蛋清、哺乳動(dòng)物的淚、唾液、血漿、乳汁等液體，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量為豐富。 其中根據(jù)其來(lái)源的不同，可以將其分為四類(lèi)，分別是植物溶菌酶、動(dòng)物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。
性質(zhì)：
1、溶菌酶純品呈白色、微黃或黃色的結(jié)晶體或無(wú)定形粉末，無(wú)異味，微甜，易溶于水，不溶于丙酮。溶菌酶遇堿易被破壞，但在酸性環(huán)境下，溶菌酶對(duì)熱的穩(wěn)定性很強(qiáng)，在pH值為4-7時(shí)，100℃處理1min，仍能較好地保持活力:pH值為3時(shí)，能耐100℃加熱處理45min。
2、溶菌酶化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，當(dāng)pH值在一定范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)幾乎不變。溶菌酶不可逆變性的臨界點(diǎn)是77℃，隨溶劑的變化，不可逆變性臨界點(diǎn)也發(fā)生變化，當(dāng)溶菌酶所處溶液pH值小于1時(shí)，不可逆變性臨界點(diǎn)降低到43℃。
3、溶菌酶適pH為5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐; 溶菌酶作為防腐劑安全性高，可被冷凍或干燥處理，且活力穩(wěn)定。
4、溶菌酶對(duì)幾種變性劑的敏感程度為:二惡烷>二甲基乙酰胺>二甲基甲酰胺>丙酮，并且隨溶劑用量的增加而直線(xiàn)下降。
制備方法：
目前溶菌酶可以以雞蛋清和蛋殼膜為材料提取制得，常用的方法有親和層析法、離子交換樹(shù)脂法、直接結(jié)晶法和聚丙烯酸沉淀法等。
1、親和層析法
親和層析法是利用蛋白質(zhì)和酶的生物學(xué)特異性，即蛋白質(zhì)或酶與其配體之間所具有的專(zhuān)一性親和力而設(shè)計(jì)的色譜技術(shù)。酶一底物復(fù)合物形成之后，在一定的條件下分離復(fù)合物便得到純凈的酶。常常使用的吸附劑為幾丁質(zhì)及其衍生物，如：幾丁質(zhì)粉、羧甲基幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)包埋纖維素、脫氨幾丁質(zhì)粉、N-酰化殼聚糖、脫氨再生幾丁質(zhì)凝膠。
2、離子交換樹(shù)脂法
離子交換法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所生的交換反應(yīng)來(lái)進(jìn)行分離的，分離的效果較好，廣泛用于微量組分的富集。一般流程為：鮮蛋一預(yù)處理一攪拌吸附一上柱洗脫一等電點(diǎn)沉淀一透析一噴霧干燥一成品。
溶菌酶在等電點(diǎn)以下較廣泛的pH值范圍內(nèi)，分子帶正電荷，可吸附于弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上，洗脫后鹽析，可得溶菌酶沉淀，再進(jìn)行精制可得成品。蛋清吸附724樹(shù)脂，洗滌緩沖液洗脫，硫酸銨溶液鹽析透析，用NaOH去堿性蛋白，凍干溶菌酶，凍干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，將新鮮蛋清540kg加入到已處理好的80kg 724樹(shù)脂中，攪拌吸附6h，在0—5℃靜置過(guò)夜。傾出上層蛋清，樹(shù)脂離心甩干，用蒸餾水反復(fù)洗去黏附的卵蛋白，然后將樹(shù)脂裝入柱內(nèi)，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸緩沖溶液約150L洗滌樹(shù)脂，再用約600L的10%硫酸銨溶液洗脫，收集洗脫液。洗脫液中加硫酸銨，使終含硫酸銨量為40%，有白色沉淀生成，冷處放置過(guò)夜。虹吸上層清液，沉淀吸濾抽干，再用1倍蒸餾水溶解沉淀呈稀糊狀，然后裝入透析袋，在約5℃的條件下，對(duì)蒸餾水透析24h左右，中間換水2—3次。離心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液與離心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氫氧化na溶液，同時(shí)不斷攪拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即離心除去。然后用3mol/L鹽酸調(diào)pH=5.0，冷凍干燥，即得白色片狀溶菌酶。也可將離心液用3mol/L鹽酸調(diào)pH=3.5，在攪拌下緩慢加入5%的固體氯化鈉，在約5℃的溫度下靜置48h，離心，沉淀用0℃丙酮洗滌，干燥，即得溶菌酶。
3、食鹽直接結(jié)晶法
在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸鹽等鹽類(lèi)，并調(diào)pH值至9.5—10.0，溶菌酶會(huì)以結(jié)晶形式慢慢析出，而大多數(shù)蛋白質(zhì)仍然在溶液。在超濾濃縮脫鹽后，為獲得較純產(chǎn)品，采用結(jié)晶純化酶液經(jīng)超濾處理后，用NaOH調(diào)整pH 9.5，離心去除。上清液在緩緩攪拌下，加NaCl至5%，靜置一周，得粗結(jié)晶。結(jié)晶溶于pH 4.6醋酸水中，分去不溶物后，進(jìn)行重結(jié)晶，結(jié)晶的終得率為60%左右。即每公斤蛋清中可得重結(jié)晶品近1.3 g，活力測(cè)定為8000U/mg。
4、聚丙烯酸沉淀法
聚丙烯酸沉淀法為將提取過(guò)濾后含酶洗脫液，首先經(jīng)過(guò)吸附步驟，即將過(guò)濾后的澄清溶液用20%的NaOH溶液調(diào)pH至6.0，在調(diào)pH值的過(guò)程中不停的攪拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值為3.0為止，靜置17個(gè)小時(shí)進(jìn)行靜析，得到粘附于底部的乳白色膠狀物。第二步解離，將前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸餾水并用0.5 mol/L的碳酸鈉，將其溶解，轉(zhuǎn)移后，將pH值調(diào)到9.5。加入5%CaCl2溶液將溶菌酶聚丙烯酸解離，至無(wú)沉淀析出，然后過(guò)濾，得到澄清溶液。第三步鹽析，將所得澄清溶液加入5%的NaCI溶液攪拌均勻。放入冰箱調(diào)溫度為0℃。待有晶體析出后，用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，置恒溫培養(yǎng)箱中40℃條件下干燥稱(chēng)重。
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