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古朵技術(shù)| 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)步驟
發(fā)布時(shí)間：2023-03-01瀏覽次數(shù)：884返回列表
實(shí)驗(yàn)原理
現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒(<15Kb)，而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒(>15Kb)。
堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH值為 12.0-12.6，堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性且無(wú)法復(fù)性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可恢復(fù)其天然構(gòu)象;在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。殘留的雜質(zhì)可以通過(guò)酚處理掉。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1、實(shí)驗(yàn)試劑
(1)溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0;
(2)溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS;
(3)溶液Ⅲ 3Ml 醋酸鉀 / 2Ml 醋酸;
(4)異丙醇，無(wú)水乙醇，75%乙醇應(yīng)放-20℃冰箱預(yù)冷備用;
酚放4℃冰箱預(yù)存;
(5)搖菌，2-3ml相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液，在37℃溫度下過(guò)夜培養(yǎng)。
2、質(zhì)粒提取
(1)菌液12000rcf離心5min，棄掉上清，加入0.2ml溶液I(已加入RNase)，充分混勻后，加入0.25ml溶液II，顛倒混勻，室溫放置5min，加入0.4ml 溶液III，顛倒混勻后，13000rcf 離心30min。
(2)上清轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中，加入等體積的酚混合液，充分混勻。10000rcf 離心10min。
(3)取上清，轉(zhuǎn)入新的EP管，加入等體積、預(yù)冷的異丙醇，充分混勻后，13000rcf 離心 6min。
(4)倒掉上清液，用1ml預(yù)冷的75%乙醇，顛倒后，13000rcf 離心 1min。
(5)倒掉上清液，沿壁加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，直接倒掉。
(6)沿壁加入1ml預(yù)冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室溫下放置10min。
待管內(nèi)液體會(huì)發(fā)干凈后，向管內(nèi)加入100ul水，55℃孵育5min。
(7)所得質(zhì)粒溶液可以放入-20℃中長(zhǎng)期保存。
注意事項(xiàng)
若菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌有一層細(xì)胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
搖床速度不宜過(guò)高。達(dá)到OD600 1.5即可。
溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。
溶液II和溶液III使用前需注意觀察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴處理。
溶液II處理菌體時(shí)間應(yīng)控制在5分鐘以內(nèi)。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
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常見(jiàn)問(wèn)題 |
原因 |
解決辦法 |
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質(zhì)粒濃度低 |
溶液處理不充分 |
增加溶液I/II/III的加入量，或降低菌液體積。 |
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質(zhì)粒拷貝數(shù)低 |
增加搖菌量，并降低后的溶解體積 |
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菌體老化 |
重新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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乙醇?xì)埩? |
乙醇的存在會(huì)影響質(zhì)粒的溶解和回收，須延長(zhǎng)乙醇揮發(fā)時(shí)間 |
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洗脫液不合適 |
可配置合適的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5） |
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洗脫體積較小 |
在保證質(zhì)粒濃度的前提下，增加洗脫液的體積 |
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質(zhì)粒有雜帶 |
菌液污染 |
重新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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試劑污染 |
質(zhì)粒提取溶液重新配置，后溶解液高壓滅菌后使用 |
培養(yǎng)基 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求”的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量”的方針。
