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凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料
發布時間：2022-08-16瀏覽次數：1105返回列表
標簽：蛋白-DNA 古朵生物 凝膠電泳
凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料
凝膠遷移實驗有稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)，是一種用于蛋白與核算相互作用的技術。初是用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、實驗原理
EMSA主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大，在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標探針發送互作。
二、實驗操作步驟
1、實驗前準備
(1)合理的實驗方案
根據研究目的合理設計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等
(2)樣本制備
可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進行定量，實驗中等量加入蛋白。
(3)探針制備
根據實驗要求設計不同的探針并添加標記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業化的抗體也可以直接購買。現在大多數實驗室已經不再使用放射性標記，生物素使用相對較多。
2、形成蛋白-探針復合物
(1)在0.5ml離心管中按順序將下列組份混勻：
蛋白樣本(2-5μg)Xμl
poly d(I-C)1μl
Binding Buffer2μl
Nuclease-Free ddH2OXμl
總體積9μl
(2)冰浴5min后，加入1μ探針。(對照組加1ul對照探針)
(3)PCR儀中室溫(20-23℃)溫育30min。
3、制備凝膠，電泳
(1)制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：(注意根據試劑情況按比例調整總體積)
5XTBE1ml
30%Acrylamide/Bis2.2ml
deionized,sterilewater6.62ml
80%Glycerol80μl
10%AP90μl
TEMED10μl
總體積10ml
(2)按標準步驟制備凝膠。
(3)加樣前先在預冷的0.5X TBE buffer中120V預電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。
(4)混合樣本及電泳緩沖液，點樣電泳。
(5)將電泳槽置于冰上或者4℃環境中，恒壓100V進行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。(大約50-60min，根據實際情況調整電泳時間及電壓;電泳時間不宜過長)
4、轉膜
(1)在預冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。
(2)按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。
(3)在預冷的0.5XTBE中進行轉膜。轉膜裝置應置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉膜1h。(注意根據實際情況調整電壓及時間)。
5、檢測
(1)去除轉好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。(注意整個檢測過程避免膜干燥)
(2)去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。
(3)加入適量的HRP酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP conjugate)，室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標記物直接加到膜上)
(4)去掉酶聯物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0min。
(5)配置反應底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。(可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產生氣泡)
(6)化學發光成像系統曝光成像(曝光時間的長短可以根據檢測方法不同而進行相應調整)。
常見問題
1、為什么看不到遷移帶?
1)蛋白樣本提取質量不高，蛋白降解或者提取量不足。
2)樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。
3)探針與蛋白無特異性的相互作用。
4)轉膜效率低，蛋白或者探針未轉移到膜上。
5)曝光或者成像時間過短。
在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因：
6)抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。
7)測定的活化的DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復合物的量的減少
8)使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。
9)多抗與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應當可以看到DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。
2、為什么實驗背景高?
1)曝光或者成像時間過長。
2)封閉時間不足或者效率不高。
3)洗滌效果不佳。
4)實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態。
3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標記的探針?
對每一個特定的結合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍;用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復合物。
部分純化蛋白與粗制核抽提液應保存在-80℃、探針應保存在-20℃以防止降解。
無論探針或是結合蛋白都應避免多次凍融。
4、Poly(dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用?
Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉錄調節因子與標記探針的非特異結合。結合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進行優化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
為確定所形成的復合物的特異性，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結合反應的競爭實驗。一般，特異競爭探針是非標記的DNA，其序列與標記探針相同，故能與標記探針競爭與結合蛋白的反應。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。如果結合蛋白與標記探針的結合被特異競爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優化或滴定，但競爭DNA通常是標記的探針用量的30-100倍(w/w)。
5、用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開?
將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合，蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA)用于不穩定的蛋白/DNA復合物。在4℃進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。
當帶型不緊密出現拖尾時，表明復合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應。在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。
凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求”的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量”的方針。
