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改良Lowry法蛋白定量試劑盒技術(shù)原理
發(fā)布時間：2022-08-09瀏覽次數(shù)：1084返回列表
關(guān)鍵詞：蛋白定量試劑盒 標準品 96微孔板 古朵生物
改良Lowry法蛋白定量試劑盒 規(guī)格：500T/1000T
分類：蛋白檢測
儲存條件：室溫,避光，12個月
用途：微板法,改良Lowry法定量檢測蛋白濃度
注意事項：利用蛋白中肽鍵與銅離子結(jié)合成四配位基銅離子復合物,后者與Folin試劑(福林酚)反應(yīng),產(chǎn)生藍色比色物,用分光光度法(酶標儀或分光光度計)檢測750nm處吸光度
簡介：
目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。改良Lowry法蛋白定量試劑盒是利用蛋白中肽鍵與銅離子結(jié)合成四配位基銅離子復合物，后者與Folin試劑(福林酚)反應(yīng)，產(chǎn)生藍色比色物，用分光光度法(酶標儀或分光光度計)檢測750nm處吸光度，并與標準曲線比較，求得待測蛋白樣品的濃度。在1~1500ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。
操作步驟：
一、準備工作
1.制備溶液A：將16mL溶液A成分二和16mL溶液A成分三加入到裝溶液A成分一的塑料瓶中，混合均勻得到240mL溶液A。注意：溶液A各成分分開提供加穩(wěn)定。
2.制備Lowry工作液：將溶液A、溶液B和溶液C按3：1：1的體積比混合得到Lowry工作液。此工作液可以室溫放置2-3周，所以好用多少配多少。如果發(fā)現(xiàn)溶液B或溶液C有沉淀，需37℃溶解并搖勻后再使用。
3.制備福林酚工作液：在裝有10mL福林酚的棕色塑料瓶中加入90mL去離子水，搖晃混勻待用。此工作液在避光條件下可以放置6個月。
二、試管法
4.先用去離子水將BSA標準(2mg/mL)稀釋到50μg/mL，然后在標記的試管中加入下列成分(單位：μL)。注意：每個樣品好做三個稀釋度，每個稀釋度好設(shè)置三次重復，陰性對照和標準品也好做三次重復。
5.每管中加入200μl Lowry工作液，振蕩混勻后室溫反應(yīng)10分鐘。
6.每管中加入100μl福林酚工作液，振蕩混勻后室溫反應(yīng)30分鐘。
7.用容量為0.5mL、光徑為1cm的玻璃比色杯或聚苯乙烯比色杯測定750nm的光吸收。測定時，先空白(即陰性對照)后樣品，測定樣品和BSA標準品時，先低濃度后高濃度。測定未知樣品前需要將杯子清洗干凈，必要時可以用甲醇清洗吸附到比色杯壁上的染料。
8.根據(jù)標準品三個重復的平均值繪制標準曲線，然后根據(jù)未知樣品的光吸收從標準曲線中查得其對應(yīng)的濃度。
三、96微孔板法
9.同上，只是反應(yīng)用96微孔板設(shè)置，用酶標測試儀750nm測定光吸收。
四、樣品中干擾物質(zhì)的去除(本產(chǎn)品不含相關(guān)產(chǎn)品，如果樣品中有干擾Lowry法蛋白定量的物質(zhì)，可另購本公司的微量蛋白質(zhì)沉淀試劑盒去除，也可以用自備試劑按下法去除：用水將樣品調(diào)到體積為200μl，加入20μl 0.15%去氧膽酸鈉，混勻，室溫放置10分鐘。加入20μL 72%的TCA，室溫放置5分鐘。3000g離心15分鐘，小心去除上清。用200μl水溶解蛋白沉淀后以用于Lowry法測定。
附：常見Lowry法蛋白定量干擾物(低于所列濃度不干擾，高于所列濃度則會干擾，需要按上法去除。不能含任何濃度的DTE，DTT和硫酸胺)。
疑難解答：
1.該方法檢測的蛋白質(zhì)濃度范圍1μg～50μg/ml。
2.由于Lowry法測定的是蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基，對于那些酪氨酸殘基數(shù)高于或低于BSA，其測定的蛋白質(zhì)含量將偏低或偏高。如果遇到該情況，需要采用BCA或Bradford法測定。
3.閱讀測定方法后化學試劑對測定方法的影響。
