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古朵生物詳述：七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
發布時間：2022-08-06瀏覽次數：1121返回列表
七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
原理介紹:酪酰胺信號放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技術是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色”步驟（HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合，使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。
TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結
合位點)，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯熒光素），來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理， 前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數大大增強。本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：480，520，570，620，690，780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現單標、雙標、三標以及多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。
試劑盒組成：480熒光染料(即用型，5mL),-20℃；520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃；570熒光染料（紅光）(即用型，5mL)，-20℃；620熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；690熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；780熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；TSA+增強劑，100ul，-20℃（可選）；
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗（20mL）4℃。
備注：480熒光染料、520熒光染料、570熒光染料、620熒光染料、690熒光染料、780熒光染料在-20度下，均為固體，使用之前需解凍。
TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。
操作流程：
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二jiabenⅠ15min-二jiabenⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風廚內， 酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。
2、抗原修復：組織切片置于盛滿PH9.0EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復（也可以用高壓1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他熱修復方法）。中火8min，停火8min，轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定）。
3、阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA-PBS（或者其他封閉液）均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X， 切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）
6、加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次， 每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。
7、熒光染料反應：XXX熒光染料反應10-15min，PBS洗三次。
8、重復2-7步驟（換用另外一種XXX熒光染料）
9、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
10、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
11、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。
| 染料 | 激發波長 | 發射波長 |
| DAPI 藍色 | 350 | 420 |
| 480 | 450 | 480 |
| 520 綠色 | 490 | 520 |
