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關(guān)于免疫熒光染色和注意事項(xiàng)介紹
發(fā)布時(shí)間：2022-06-02瀏覽次數(shù)：1117返回列表
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
免疫熒光染色
(1）冰凍切片用0.01moULPBST（或PBS）漂洗或沖洗3次，每次5min。
(2)3%H2O2孵育10min，再用0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min。
(3)5％一8％的正常動(dòng)物血清（山羊或馬血清）孵育30-60min。
(4）洗掉血清，滴加一抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過(guò)夜。
(5）吸出一抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次5min，加入熒光標(biāo)記的二抗（0.01mol/LPBS配制），4℃過(guò)夜。
(6）吸出二抗，0.01mol/LPBS沖洗3次，每次10min。
(7）封片劑封片，熒光顯微鏡觀察照相。典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖20.2B。
注意事項(xiàng)：
(1)由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個(gè)小時(shí)，因此，熒光二抗應(yīng)避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應(yīng)盡早照相，目前有市售的熒光增強(qiáng)劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。
(2)常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、AlexaFluor488和GFP；紅色熒光：TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed；藍(lán)色熒光：Hoechst、DAPI；黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
(3）不同的熒光素激發(fā)的波長(zhǎng)不同，因此，選用濾光片時(shí)要注意。一般紫外線的激發(fā)波長(zhǎng)為334-365nm，藍(lán)光的激發(fā)波長(zhǎng)為435-490nm，綠光的激發(fā)波長(zhǎng)為546nm左右。
(4)熒光顯微鏡應(yīng)提前至少15min打開(kāi)汞燈預(yù)熱。關(guān)閉30min后方可再開(kāi)啟。
(5）免疫熒光的組織要求很高，載玻片及蓋玻片要干凈無(wú)雜質(zhì)。進(jìn)行熒光染色時(shí)，需注意染液的pH、濃度和染色溫度，還要避免對(duì)熒光有熄滅作用的物質(zhì)的接觸。組織和細(xì)胞也有自發(fā)熒光，如紅細(xì)胞中的血紅蛋白呈紅色熒光，維生素A呈綠色自發(fā)性熒光等。
