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慢病毒實驗相關操作方法與問題解答
發布時間：2021-12-27瀏覽次數：1061返回列表
慢病毒（Lentivirus）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎發展起來的基因治療載體，它可以感染分裂細胞和非分裂細胞，可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動物細胞、干細胞和原代細胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而可以在體內較長期表達。慢病毒的多種優點，使它成為基因傳遞的強大而有效的工具，獲得了廣泛的應用。因此，慢病毒成為了實驗室的一大常客。在使用慢病毒的過程中，我們會遇到一些問題，比如細胞轉染效率低，細胞狀態差等等。為了在實驗過程中好地使用慢病毒，我們應該注意哪些問題呢？
慢病毒載體是經過處理的HIV，理論上對人體是無害的，但病毒仍然具有潛在的生物學危險，慢病毒相關實驗需要在生物安全柜（BL-2級別）內進行操作。因此在進行操作的時候，我們要按照如下基礎規范進行實驗：
1、在進入實驗室工作時，穿著實驗服或隔離服，戴上手套和口罩；
2、操作病毒時請盡量使用生物安全柜，小心不要產生氣霧或液體飛濺；
3、如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請在打開含有病毒的容器蓋子前關閉超凈臺的風機（由于超凈臺風向外排，有可能將病毒吹向操作者），并盡快操作；盡量縮短開蓋后的病毒在關閉了排風機的超凈臺中停留的時間，封閉所有含有病毒的容器、耗材、廢液后，再打開超凈臺風機；
4、如果操作時臺面有病毒污染，請立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板，培養液請用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡過夜后棄去；
5、如需離心，應使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后離心；
6、實驗結束，脫掉手套前先消毒再摘除手套，隨后用肥皂洗手。
慢病毒的儲存與稀釋
1、病毒長期儲存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超過1周，4℃保存不要超過3天；
2、病毒的運輸采用干冰，收到病毒液后若幾天內用于實驗，可于4℃保存（于3天內用完）。若短時間內不用，收到病毒后應立即放入-80℃冰箱進行長期保存。病毒使用過程中要避免反復凍融，否則會降低病毒滴度；
3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放時間超過6個月后使用，需重新檢測病毒滴度；
4、需要稀釋病毒時，將病毒從-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培養基（不含血清）稀釋到所需濃度后輕柔混勻，盡快使用；
慢病毒的使用
預實驗摸索慢病毒的佳MOI
每種細胞對慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的熒光強度也有差異，所以進行慢病毒操作實驗之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染復數）是指病毒感染細胞的比例。
選擇合適的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表達量越高，相對細胞的毒性越小。對于分裂活躍的細胞，比如293細胞MOI=1時，95%以上的細胞均可以表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染效率較低，MOI值可能達到200-300。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染細胞MOI值的摸索。
1、感染前一天，一般用24孔板接種2×10?個細胞，第二天病毒感染時的細胞匯合度達到40-50%左右；
2、MOI值的設置若有文獻參考，可以參考值為中心設置梯度覆蓋參考值，舉例：文獻中某細胞系慢病毒MOI值為10，則設置MOI梯度為2.5,5,10,20,40等；若無文獻參考可按10倍梯度稀釋進行設置，每個梯度3次重復；
注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*細胞數/滴度（TU/mL）*10?
一般第二天按照細胞數倍增計算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量過少，可進行稀釋后再加；Polybrene（常用濃度為5-10μg/mL）是否添加根據細胞種類及具體實驗決定；
3、第三天（加病毒后12h-24h左右），棄去含病毒就培養基，換新鮮培養基繼續培養；
4、第五天，觀察熒光情況，并進行拍照，確定適合MOI值；
5、對于生長緩慢代謝慢的細胞，可以適當延長病毒感染時間，根據細胞狀態決定何時換培養基，保持細胞的活性。
慢病毒感染目的細胞
1、通過感染預實驗，確定細胞接種密度、佳MOI等條件。正式實驗前，調整并保持良好的細胞狀態；
2、按實驗需要將細胞鋪板（qPCR檢測用12孔板，WB檢測用6孔板或大面積的培養皿），細胞數以第2天密度約40-50%為宜，37℃ 培養過夜；
3、感染前，從-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀釋成所需濃度，用移液器吹打均勻；
4、感染前給細胞換液，然后向每孔中均勻滴加稀釋好的病毒液，輕輕搖勻，37℃培養過夜；
5、感染后根據細胞狀態決定，換新鮮的完全培養液，繼續37℃培養。若病毒對細胞性也可不換液。感染后48-72h觀測熒光，拍照記錄；
6、根據需要，或收細胞抽提RNA檢測目的基因在mRNA水平的表達，或收細胞抽提蛋白檢測目的蛋白的表達，或收細胞進行細胞功能檢測；
7、在培養過程中，需要篩選穩定攜帶 Puromycin 抗性基因的病毒，則需換上含適當濃度 Puromycin 的新鮮完全培養液。
慢病毒在使用過程中可能遇到的其他問題
如何使用慢病毒感染細胞？
使用慢病毒感染細胞的操作流程取決于細胞種類，因此首先要了解細胞的來源和背景。通常來講首先要根據MOI和需要感染細胞量計算所需要的病毒量，然后將所需病毒液加入培養體系后4小時左右即可換成完全培養基正常培養。
慢病毒染后為什么細胞中出現大量黑點，并影響細胞生長？
在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片，導致細胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：
a. 慢病毒使用量過多，或細胞數量過少；
b. 支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。
但支原體易在病毒感染細胞后爆發，故會出現大量細胞碎片。建議在使用病毒制品時，應首先排除細胞、培養物及培養環境中的支原體污染，以節約時間。
病毒感染目的細胞感染不上或效率低？
和以下幾個因素有關：
1、病毒活性：解凍病毒一定要在冰上進行，盡量避免反復凍融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新測滴度；
2、目的細胞：好預實驗測試過，看病毒載體是否合適感染目的細胞。一些難感染的細胞，如懸浮細胞，原代細胞等，或者動物實驗適合用腺病毒或AAV；
3、MOI值：一般來說MOI都是要用梯度法來摸索的，同的病毒感染不同的細胞的MOI值也不一樣，如果感染細胞所用的病毒量不夠的話，感染效率肯定不好；需要確認MOI計算及細胞計數的準確性。
4、感染時間：慢病毒一般在感染后24h換液，感染后換液太早會導致感染效率下降；感染后換液太晚，則對細胞的損傷太大，效率也不高。感染后48h開始觀察熒光，由于慢病毒的表達時間較長，有的72h，120h才能看到熒光。
5、其他：是否加入 polybrene 以及熒光顯微鏡的使用等因素有關
要曝光很長時間才能觀察到熒光？
要曝光很長時間才能觀察到的熒光，說明熒光比較弱，可能的原因有：
1、顯微鏡汞燈使用時間長，這個可以通過對照排除，看是否有比較亮的對照，或者如果有其他比較亮的樣品，證明不是汞燈的問題。
2、PH值低，看培養基是否發黃導致綠色熒光猝滅。
3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒熒光強度與對照相比弱一些，這個屬于正常現象，增加曝光時間，看感染上的陽性細胞比例如何，看看目的和對照的熒光的差異，如果感染比例尚可，差異不是很大，用Puromycin篩選有大量細胞存活，則病毒也可以使用。
