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植物DNA提取中的常見問題解答
發布時間：2021-11-02瀏覽次數：1117返回列表
提取植物DNA時遇到多糖成分的干擾， DNA質量一直不高，如何消除多糖的影響？
參考見解：一般來說，SDS法提取的DNA會還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：
1、 在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。
2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無水乙醇，迅速混勻，多糖會先沉淀。
3、
沉淀 DNA 時，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac
使終濃度為 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13%
PEG 8000（冰浴 1 h）。
4、 多糖和 DNA 的共沉淀物進行再分離。如用 TE緩沖液反復清洗共沉淀
物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或將沉淀物溶解后，經瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還
有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖 。
上述方法還可組合使用，以達到佳效果。然而這些方法均會在一定程度上減低
DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對 DNA 具有 特異性吸附的樹脂來純化 DNA。曾有文獻提到選用
Wizard Purification Kit，PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic
tip 500/G ，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。
血樣4度保存了2月，現在按照酚常規提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？
參考見解：按照常規的酚/lv仿法不可能提不出來，下面是參考方法：
1、 先洗出白細胞，好有1毫升以上血液。
2、 加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。
3、 加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過夜。
4、 用等體積的（酚，lv仿，yi戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。
5、 取水層，加入3倍體積-20℃預冷無水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。
CTAB法提取水稻基因組DNA，
TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測，點樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI
公司產的限制性內切酶酶切過夜，鑒定時發現DNA已經被完全切爛，只在溴酚藍前存在微弱smear狀產物。換用酶，換EP管，滅菌水之后重復幾次，結果還是如此。拿其他人的DNA
做對照，酶切結果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？
參考見解：
1、 公司的酶不行。
2、 如做酶切，DNA好不用異丙醇（因其不易揮發）而用無水乙醇沉淀。
3、 酶量大或作用時間太長了。
建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說明書進行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內切酶的活性減少DNA的降解；
要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細胞然后破壞紅細胞得到的結果有何差異？
參考見解：
1、 覺得還是先分離細胞好，因為DNA和RNA大都是在細胞核內，有紅細胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細胞分離液先分離有核細胞的，效果還是不錯的。
2、 現在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細胞，能得到多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒必要。
3、
如果對基因組的要求不高，可以試試這個方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml
Eppendorf管中，加無菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L
KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μllv仿/yi戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10
000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10
000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無水乙醇1000μl，10
000r/分鐘離心5分鐘；棄去無水乙醇，37℃烤干；50μl無菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。
從經福爾馬林處理后的組織標本中提取DNA可以嗎？
參考見解：可以的。
100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚lv仿yi戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質，離心幾次都沉淀不下來，請問是哪里出了問題？
參考見解：一般來說，蛋白酶的作用是將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細胞壁，二者作用各異，不可替代。對于實驗中的蛋白問題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復抽提幾次試試。
一般植物DNA提取的時候都不加蛋白酶K，這樣提出來的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來酶切嗎？
參考見解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細胞，在動物細胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：
1、 消化組蛋白，釋放出DNA。
2、 消化DNAse，提高DNA分子量。
建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來的 DNA分子量會高一點，且純。
提孢子的總DNA，孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？
參考見解：液氮研磨的方法應該可行的，做動物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應該是可以的。
在CTAB法提取DNA時，有一些品種沒有DNA析出，是什么原因？
參考見解：
1、 用預冷的異丙醇來沉淀試試，同時研磨的時候要研的非常非常的細。
2、 沒有看到析出物并不代表沒有沉淀，可以繼續下一步試驗，溶解的時候少加一點兒。
3、 高離子強度下DNA與CTAB能形成共沉淀。可能DNA就這樣留在沉淀里了。
提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，怎樣好的抑制內源核酸酶的活性？
參考見解：在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔。
用試劑盒對農田土壤的的微生物群落DNA進行提取，雖然總DNA提出來了，可是用細菌的通用引物進行PCR的時候卻怎么也擴不出來，請有沒有什么好的辦法可以解決這個問題？
參考見解：環境特別是土壤的樣品成分復雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質，因此用一般的國內試劑盒無法提純。應當選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。
洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？
參考見解：細胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。
洗滌產物中DNA量很少或沒有？
參考見解：
1、 樣品中細胞或者病毒濃度低。
2、 裂解液和樣品混合不均勻造成細胞的裂解不充分。
3、 蛋白酶K活性下降造成細胞裂解的不充分。
4、 溫浴時間不夠造成的細胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長溫浴時間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。
5、 在上柱前，裂解物中沒有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇。
6、 DNA沒有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。
7、 洗脫液pH不合適，低pH值會減少DNA產率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過200ul洗脫體積所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。
