一、目的：

建立培養(yǎng)基適用性檢查操作規(guī)程，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二、適用范圍：

本規(guī)程規(guī)定了培養(yǎng)基適用性檢查方法和操作要求，適用于微生物實驗室計數(shù)用培養(yǎng)基、控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。

三、內(nèi)容：

1、簡述

1.1 培養(yǎng)基適用性檢查試驗可用于確定實驗室所使用培養(yǎng)基(包括購置的不同批號的成品培養(yǎng)基、不同批號的脫水培養(yǎng)基、按處方自行配制培養(yǎng)基所用不同批次的原材料等)、制備程序（包括水質(zhì)控制、配制方法、滅菌程序等）、保存條件（溫度、濕度、時間及盛裝培養(yǎng)基的容器條件等）等是否滿足微生物限度檢查要求。

1.2 計數(shù)用培養(yǎng)基適用性檢查包括需氧菌、霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)。

1.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。

2 計數(shù)用培養(yǎng)基適用性檢查

微生物限度檢查中計數(shù)用培養(yǎng)基有5種，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基。

2.1 培養(yǎng)基及配制

2.1.1 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基；R2A瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂對照培養(yǎng)基；平板計數(shù)培養(yǎng)基。

2.1.2 配制：照《培養(yǎng)基配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》配制。

2.2 試劑及稀釋劑配制

2.2.1 試劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、聚山梨酯80、氯化鈉。

2.2.2 稀釋劑配制

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：稱取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液14.63g,加水1000mL溶解，分裝，滅菌（121℃、15min）。

0.05％（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取已經(jīng)滅菌好的聚山梨酯80（1mL），加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，搖勻，即得。

0.9％無菌氯化鈉溶液：稱取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000mL，分裝，滅菌（121℃、15min）。

3 試劑及消毒液配制

3.1 試劑

新潔爾滅溶液、84消毒液、苯酚、75％醫(yī)用消毒酒精。

3.2 消毒液配制

3.2.1 84消毒液：取84消毒液1ml，加水60ml(1：60)，搖勻即得。

3.2.2 0.1％新潔爾滅溶液：取新潔爾滅溶液20.4ml，加水至1000ml，搖勻，即得。

3.2.3 5％的苯酚溶液：稱取苯酚5g，加水至100ml,搖勻，即得。

3.2.4 75％酒精棉球：取滅菌脫脂棉撕成小塊并揉捏成團，置于廣口瓶內(nèi)，加入75% 醫(yī)用消毒酒精，充分浸潤，即得。

4 試驗用菌株及菌液制備

4.1 試驗用菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］

枯草芽孢桿菌（Bacillus s aureus）［CMCC(B)63501］

白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］

黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC(F)98003］

4.2 菌液制備

4.2.1 儀器與用具

儀器：生化培養(yǎng)箱（30～35℃）、霉菌培養(yǎng)箱（20～25℃）、恒溫水浴鍋。

?用具：酒精燈、打火機、吸耳球、試管架、大試管（20×200mm、15×200mm）、錐形瓶、硅膠塞、刻度吸管（1mL、2mL、5mL/10mL）、吸管桶、接種環(huán)、培養(yǎng)皿（90mm）、不銹鋼培養(yǎng)皿桶、不銹鋼吸管桶、玻璃專用筆。

5 菌液制備方法

5.1 金黃色葡萄球菌菌液制備方法

5.1.1 用無菌接種取金黃色葡萄球菌斜面中底部菌落一環(huán)，在裝有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL的試管內(nèi)壁上輕輕摩擦，使環(huán)上的菌苔全部洗于溶液中，振搖混勻。

5.1.2 用1ml無菌吸管吸取上述均勻菌液0.1mL加入裝有9.9mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。

5.1.3 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液，備用。

5.2 枯草芽孢桿菌菌液制備方法

照金黃色葡萄球菌菌液制備方法同法操作。

5.3銅綠假單胞菌菌液制備方法

照金黃色葡萄球菌菌液制備方法同法操作。

5.4 白色念珠菌菌液制備方法。

5.4.1 用無菌接種取白色念珠菌斜面中底部菌落一環(huán)，在裝有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml的試管內(nèi)壁上輕輕摩擦，使環(huán)上的菌苔全部洗于溶液中，振搖混勻。

5.4.2 用1ml無菌吸管吸取上述均勻菌液0.1ml加入裝有9.9ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。

5.4.3 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液，備用。

5.5 黑曲霉液制備方法

5.5.1 取黑曲霉的斜面一支，加入20ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液于上述斜面培養(yǎng)物中，將孢子洗脫。

5.5.2 用管口帶有薄的無菌棉花的無菌吸管吸出全部孢子懸液，裝入另外一支無菌試管中，混勻，作為原液。

5.5.3 用1ml無菌吸管從試管中吸取0.1ml至另一支裝有9.9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，作為10-1級。

5.5.4 以此類推，10倍遞增稀釋至每1ml含菌數(shù)不大于100cfu的孢子懸液，備用。

5.6 注意事項

5.6.1 每一稀釋級，均需制備2個菌數(shù)計數(shù)平皿。（每一稀釋級取2個無菌平皿，每皿接種1ml菌液，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，計數(shù)；白色念珠菌、黑曲霉傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，凝固后于20～25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h，計數(shù)。

5.6.2 每遞增一稀釋級，必須另換一支吸管。

5.6.3 稀釋時，吸管插入上一級試管內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹數(shù)次。

5.6.4 吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管刻度上部少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至下一稀釋試管的內(nèi)壁近液面處（切勿接觸液面）緩慢地放出全部試液。

5.6.5 所用稀釋菌液吸管均需放入裝有5％苯酚溶液的消毒缸內(nèi)，24小時后才能洗滌。

5.6.6 菌懸液制備后，若在室溫下放置應(yīng)在2h內(nèi)使用，若在2～8℃冰箱保存的菌懸液可以在24h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可在2～8℃冰箱保存，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

6 計數(shù)用培養(yǎng)基的適用性檢查

6.1 實驗操作

6.1.1 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

接種方法

分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20ml胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查

將接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于30～35℃培養(yǎng)不超過3天；將接種白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于20～25℃培養(yǎng)不超過5天。

6.1.2 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

接種方法

分別接種不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20ml沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查

將接種白色念珠菌、黑曲霉培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于20～25℃培養(yǎng)不大于5天。

6.1.3 R2A瓊脂培養(yǎng)基

接種方法

分別接種不大于100cfu的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液于無菌平皿中，傾注約20mlR2A瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查

將接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于30～35℃培養(yǎng)不大于3天。

6.1.5 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基

接種方法

分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液于無菌平皿中，傾注約15ml該培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，輕輕搖勻。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查

將接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于30～35℃培養(yǎng)不超過3天；將接種白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)皿、對照培養(yǎng)皿于30～35℃培養(yǎng)不超過5天

6.2 觀察與計算

觀察被檢培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形態(tài)、大小與對照培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形態(tài)、大小是否一致。

依次計算被檢培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均數(shù)的比值。

6.3 結(jié)果與判斷

若被檢固體上的菌落數(shù)平均數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，各菌適用性檢查符合規(guī)定。

若被檢固體上的菌落數(shù)平均數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)平均數(shù)的比值低于0.5～2范圍，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落不一致，則判斷該培養(yǎng)基的適用性查不符合規(guī)定。

7 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查

控制菌檢查用培養(yǎng)基有液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

7.1 培養(yǎng)基及制備

培養(yǎng)基：脫水培養(yǎng)基、對照用培養(yǎng)基。

制備：照培養(yǎng)基配制規(guī)程新鮮配制。

7.2 試驗用菌株及菌液制備

試驗用菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44102］

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCCB(B)63501]

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］

沙門菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC(B)50094］

白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］

7.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基需要測試的能力及判斷指標(biāo)

7.3.1 液體培養(yǎng)基

促生長能力檢查

取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）或（42～44℃）及短培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗菌應(yīng)生長良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁。

指示特性檢查

取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）或（42～44℃）及短培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長情況/指示劑反映情況應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。

抑制能力檢查

取不大于100CFU的試驗菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）或（42～44℃）及長培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。

7.3.2 固體培養(yǎng)基

促生長能力檢查

取試驗菌液（含菌數(shù)不大于100CFU）分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃或（42～44℃））及短培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。

指示特性檢查

取試驗菌液（含菌數(shù)不大于100CFU）分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）或（42～44℃）及短培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落形態(tài)特征、菌落顏色及指示劑反應(yīng)情況應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。

抑制能力檢查

取試驗菌液（含菌數(shù)不少于100CFU）分別接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）或（42～44℃）及長培養(yǎng)基時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。

7.4 培養(yǎng)基能力測試列表

控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查項目、菌株及判斷指標(biāo)

7.5 實驗操作

7.5.1 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu，搖勻，培養(yǎng)。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查：30～35℃培養(yǎng)不超過3天。

7.5.2 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：接種白色念珠菌于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu，搖勻，培養(yǎng)。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗。

適用性檢查：20～25℃培養(yǎng)不超過3天。

7.5.3 RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，與對照培養(yǎng)基管比較。

抑制能力檢查

接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基管

比較。

7.5.4 麥康凱液體培養(yǎng)基適用性檢查

促生長能力檢查

接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中。

適用性檢查：在42～44℃條件下培養(yǎng)18～24h，與對照培養(yǎng)基管比較。

抑制能力檢查

接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基

中。

適用性檢查：在42～44℃條件下培養(yǎng)24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基管比較。

7.5.5 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

促生長能力+指示特性的檢查

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h。

7.5.6 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基

促生長能力+指示特性的檢查

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h。

7.5.7 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、

指示能力

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的沙門菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基高層斜面上，便進行穿刺。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h。

7.5.8 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基

促生長能力+指示特性的檢查

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h。

抑制能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較。

7.5.9 溴化十六烷基3甲銨瓊脂培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：用涂布法接種不大于100cfu的銅綠假單胞菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)

基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，與對照培養(yǎng)基比較。

抑制能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較。

7.5.10 腸道菌增菌液體培養(yǎng)

促生長能力檢查

接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，與對照培養(yǎng)基管比較。

抑制能力檢查

接種方法：分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基管比較。

7.5.12 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培

養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較。

抑制能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基比較。

7.5.13 念珠菌顯色培養(yǎng)基

促生長能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培

養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較。

抑制能力檢查

接種方法：用涂布法分別接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h，并將被檢培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基比較。

7.5.14 MUG培養(yǎng)基

促生長能力+指示特性的檢查

接種方法：分別接種不大于100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板中。

適用性檢查：在30～35℃條件下培養(yǎng)18～24h。

8 注意事項

8.1 培養(yǎng)基的配制方法和滅菌程序發(fā)生變時，應(yīng)再次對培養(yǎng)基進行適用性檢查。

8.2 培養(yǎng)基批號發(fā)生變時，應(yīng)再次對培養(yǎng)基進行適用性檢查。

8.3 培養(yǎng)基供應(yīng)商發(fā)生變時，應(yīng)再次對培養(yǎng)基進行適用性檢查。

9 記錄

每一次進行培養(yǎng)基的適用性檢查后在《培養(yǎng)基適應(yīng)性驗證記錄》上記錄。