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超純質粒制備操作細則 古朵生物√
發布時間：2021-03-23瀏覽次數：1314返回列表
1溶液配制:
1.1 Buffer P1:(懸浮用)
成分：50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A
配制：
2M Tris.HCl, pH 8.0 25mL
0.5M EDTA, pH 8.0 20mL
雙蒸水至 1L，滅菌。
使用前每1L buffer加入100mg RNAse A，并于4℃保存。
1.2 Buffer P2：（裂解用）
成分：200mM NaOH, 1% SDS
配制：
8g NaOH固體溶解于500mL雙蒸水中，成0.4M NaOH溶液
10g SDS溶于500mL雙蒸水中，成2% SDS溶液
使用前將上述兩種溶液等體積混合后使用
注意：
Buffer P2混合后不宜放置時間過場，每次配夠一周使用的即可。長時間放置容易產生沉淀。若有沉淀產生，在37℃保溫一段時間使沉淀溶解。
1.3 Buffer P3：（中和用）
成分：3M KAc（醋酸鉀），pH4.8
配制：將147g KAc 溶于350mL雙蒸水中，用約60mL冰醋酸調節PH值，然后繼續用濃鹽酸調節pH值至約5左右.蕞后定容至500mL。
1.4 Buffer QBT:(平衡用)
成分：750mL NaCl; 50mM MOPS.Ph7.0;15% 異丙醇，0.15% Triton X-100
配制：溶解43.83g NaCl, 10.46g MOPS到800 mL 雙蒸水中，調節pH值至7.0，然后加入150mL 異丙醇和15Ml Triton X-100,加水定容至1L。
1.5 Buffer QC：（洗滌用）
成分：1.0 M NaCl，50Mm MOPS, Ph7.0
配制：溶解58.44g NaCl, 10.46 MOPS至800 mL 雙蒸水中，調節pH值至7.0,然后加入150mL異丙醇，定容至1L。
2 Qiagen-tip 20質粒小量提取操作步驟
2.1 取過夜培養的菌液2mL，12000rpm離心30秒至1分鐘，去凈上清。
2.2用0.3mL Buffer P1重新充分懸浮沉淀。
2.3加入0.3mL Buffer P2，輕輕顛倒搖勻，室溫下放置5分鐘。
注意：此步不應劇烈振蕩，否則容易在所提質粒中混入基因組DNA。
2.4 Buffer P2使用后應蓋緊蓋子，否則NaOH易與空氣中的CO2起反應。
2.5 加入0.3mL Buffer P3，輕輕混勻，于4℃冰箱中放置10分鐘。
12000rpm高速離心15分鐘。
2.6 用1mL Buffer QBT平衡Qiagen-tip 20柱，并讓QBT慢慢流下。
2.7 將步驟5所得的上清倒入已平衡好的Qiagen-tip 20柱，讓其慢慢流下。
2.8 每次用1mL QC清洗Qiagen-tip 20柱，清洗3次。
2.9用0.8mL QF洗脫DNA。
2.10 用0.6倍體積（500uL）的異丙醇沉淀質粒，顛倒混勻，室溫放置5分鐘,12000rpm高速離心15分鐘。
2.11去上清，用1mL 70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm高速離心3分鐘，去凈上清。
2.12重復步驟11一次。
注意：洗滌時，每次用吸水紙吸一下，盡量去凈殘余的液體。
去凈上清很重要，否則除不凈多余的鹽分，將嚴重影響的后面的測序反應。
2.13 抽干多余的乙醇，用30～50uL雙蒸水溶解DNA,取2uL電泳檢測定量，用于測序。
3 Qiagen-tip 20柱子的清洗處理
3.1用5mL緩沖液清洗柱子，洗去多余的DNA及其他雜質，備用。
