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基因克隆：高效感受態細胞制作
發布時間：2020-11-26瀏覽次數：1148返回列表
方法一
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；
C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。
劃線得到單菌落，37℃培養箱培養約17小時， 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶。
37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4小時，將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養，其余與普通感受態差不多，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。
用紗布將所有裝有感受態的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。
效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。
潔凈是zui重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g，建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。
預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態效率提高有幫助，第1次多加一點緩沖液，我經常加至20ml，效果不錯。
關于大腸桿菌的感受態制備及轉化的方法很多，zui復雜的莫過于電轉化，而zui-簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉化。對于做克隆工作的人而言，高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。
現在大腸桿菌轉化效率zui-高的要數電轉化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，zui-好的莫過于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態的制備與轉化方法。
根據實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2、培養基的裝量：培養基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高于此值為：培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，zui-好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養后的OD值。其實這并一個非常重要的參數，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大于0.6，0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態絕-對數量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。
5、培養基中的各種離子。經驗證明，當培養基中存在一定量的Mg2 離子時，該方法制得的感受態要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養基的添加物，在感受態收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。
6、培養溫度。文獻及經驗告訴我們，較低的溫度培養有利于感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了Inoue的高效感受態制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。
7、此外文獻報道，在保存感受態時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。
8、液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然后保存于超低溫冰箱內。至于在液氮中保存12小時以后再轉入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第1次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。
方法二
1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5，JM109，HB101等，在LB平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。
2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養基. 培養基量不可再多，會影響效率。
3.在18度150-250RPM 培養19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度。
4.OD600約0.4-0.8時停止培養，放在冰水中冷卻10分鐘。
5. 4度，300RPM離心15分鐘，回收菌體。
6.去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘。
7.再次離心回收菌體。
8.用1/12.5體積的TB懸浮，添加zui終濃度為7%的DMSO，再冷卻10分鐘。
9.0.1 -1毫升分裝，直接在液氮中凍上。
10.在液氮或-80度保存。
【zihudie 】
（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養活化。
（2）挑取經活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養基，18℃，200-250rpm培養。
（3）當OD600=0.5-0.8時，用預冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（4）用預冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（5）重復第4步操作。
（6）用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中。
本法效率極高，建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過夜------1%轉接-------37度 200RPM2小時(OD到0.4~0.5)
2. 2ml，冰浴15min，4度，6000RPM 5min，棄上清，懸浮于1ml0.1MCaCl2 中，冰浴20min
3. 4度，6000RPM 10min，重懸浮于200μl0.1MCaCl2中，冰浴30min
建議用TSS法，簡單方便，比氯化鈣法的轉化效率高.別的菌可能不一定適用。
以下為轉貼，具體方法請zui-好查閱文獻。
E.coli感受態細胞制備方法:
單菌落平板至2ml LB，37℃ 250 r/m，1ml 轉至50 ml LB，37℃ 250 r/m至 A600=0.2-0.4
離心后用10毫升TSS重懸后，分裝 -70℃保存。盡量冰上操作.
轉化: 加質粒(<5 ul/100μlcell) 后冰上30分鐘，42℃ 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml，37℃ 1小時后鋪抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2 (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O
