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古朵技術(shù)：細(xì)胞裂解提取蛋白的步驟
發(fā)布時(shí)間：2020-09-01瀏覽次數(shù)：1125返回列表
在實(shí)驗(yàn)過程中，我們常常需要證明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組某些蛋白質(zhì)是多了還是少了，那么我們就需要先把細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)提取出來進(jìn)行測(cè)量，今天就給大家介紹一下細(xì)胞與組織蛋白質(zhì)提取的基本知識(shí)和步驟。
蛋白樣品制備的原則：
1.盡可能采用簡(jiǎn)單方法，以避免蛋白丟失；
2.細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白質(zhì)的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)的降解；
3.樣品裂解液應(yīng)新鮮制備，并分裝存于-80℃，勿反復(fù)凍融已制備好的樣品；
4.通過超速離心清除其余雜質(zhì)。
一般的理解方法分為溫和的裂解方法和劇烈的蛋白裂解方法。
溫和的裂解方法
用于組成比較簡(jiǎn)單的樣品，或分析某一特定的細(xì)胞器。
（1）滲透裂解：血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞
（2）凍融裂解：細(xì)菌、組織培養(yǎng)細(xì)胞；液氮凍融
（3）去污劑裂解：用去污劑溶解細(xì)胞膜、裂解細(xì)胞，釋放內(nèi)容物；用于組織細(xì)胞
（4）酶裂解細(xì)胞：植物、細(xì)菌和真菌等含有細(xì)胞壁的細(xì)胞
劇烈的蛋白裂解方法
常用于難于破碎的細(xì)胞，如固體組織內(nèi)的細(xì)胞，或具有堅(jiān)硬細(xì)胞壁的細(xì)胞，如酵母細(xì)胞。
（1）超聲波裂解法：細(xì)胞樣品
（2）弗氏壓碎器：高壓下迫使細(xì)胞穿過小孔徑而產(chǎn)生剪切力，從而裂解細(xì)胞；常用于含有細(xì)胞壁的微生物、藻類
（3）研磨法：常用于固體組織、微生物；凍存于液氮中，隨后研磨成粉末
（4）機(jī)械勻漿法：
（5）玻璃珠勻漿法：利用劇烈振蕩的玻璃珠打破細(xì)胞壁；用于細(xì)胞懸液或微生物
那么蛋白提取的步驟來了：
所需器材：低溫高速離心機(jī)，勻漿攪拌器，超聲儀，真空泵，細(xì)胞掛勺等。
所需試劑：RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑（PMSF）,無菌PBS等。
蛋白樣品提取
1、細(xì)胞蛋白的提取：
1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取出需要提取的細(xì)胞培養(yǎng)板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均應(yīng)在在冰上進(jìn)行。
2.每孔細(xì)胞（六孔板）中加入 1-2ml 4℃預(yù)冷的PBS溶液。平放輕輕搖動(dòng)十秒鐘清洗細(xì)胞，然后吸除洗液，共清洗洗細(xì)胞三次（目的是去除剩余的上清液），zui后一次不吸除上清液。
3. 用刮勺將細(xì)胞輕輕刮下，接著用移液器將細(xì)胞和上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，置入4度離心機(jī)（提前開離心機(jī)預(yù)冷），離心1.5min，棄去上清液。
4.配置裂解液（所用裂解液為RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分釋放），每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合）。PS：PMSF屬于蛋白酶抑制劑，可以減少蛋白質(zhì)的講解，另外的蛋白酶抑制劑還可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同時(shí)加入多種蛋白酶抑制劑。
5.將配置好的裂解液加入第3步獲得的細(xì)胞沉淀中，一般5*10^6個(gè)細(xì)胞加入100ul的裂解液，然后吹打重懸，使細(xì)胞充分裂解。
6.用超聲儀進(jìn)一步裂解細(xì)胞：將細(xì)胞放置于冰上進(jìn)行超聲，一般功率選擇為15%左右，裂解時(shí)間為1分鐘（超聲2s，休息4s），當(dāng)超聲一次后，離心管仍比較渾濁，可以間隔幾分鐘再次超聲。
7.超聲結(jié)束后，將細(xì)胞于4度離心機(jī)，12000rpm離心 25min。
8.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，保存于－80℃?zhèn)溆谩?br />
2、組織中總蛋白的提取：
1.將少量組織塊置于 1.5ml離心管中，加入500ul含PMSF的強(qiáng)RIPA裂解液，先用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，當(dāng)組織較軟時(shí)（如腦組織），接著用1ml槍頭不斷地吹打吸取，然后用勻漿器進(jìn)一步打碎組織，zui后用超聲儀進(jìn)行超聲裂解；當(dāng)組織較韌時(shí)（如肌肉組織），可以直接用勻漿器打碎組織，zui后用超聲儀進(jìn)行超聲裂解。（裂解組織就是通過不同的方法讓組織塊不斷變小）。
2.同上方法，將離心管置入 4度離心機(jī)，12000rpm離心25min，取上清分裝于1.5ml離心管中并置于－80℃保存
