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古朵技術：生物大分子樣品的保存
發布時間：2020-08-13瀏覽次數：1211返回列表
生物大分子制成品的正確保存為重要，一旦保存不當，辛辛苦苦制成的樣品失活、變性、變質，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。
影響生物大分子樣品保存的主要因素有：
⑴空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化。空氣中微生物的污染可使樣品腐-敗變質，樣品吸濕后會引起潮解變性，同時也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會自發引起游離基鏈式反應，還原性強的樣品易氧化變質和失活，如維生素C、巰基酶等。
⑵溫度：每種生物大分子都有其穩定的溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應約加快數倍，酶促反應增加1～3倍。因此通常大多數樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學反應和微生物的生成。
⑶水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。
⑷光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對生物大分子制品影響zui大，樣品受光催化的反應有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。
⑸樣品的pH：保存液態樣品時注意其穩定的pH范圍，通常可從文獻和手冊中查得或做實驗求得，因此正確選擇保存液態樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。
⑹時間：生化和分子生物學樣品不可能永-久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。
現以保存蛋白質和酶為例：
⑴低溫下保存：由于多數蛋白質和酶對熱敏感，通常35℃～40℃以上就會失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白質和酶越純越不穩定，溶液狀態比固態geng不穩定。因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存則zui-為理想。少數酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。還有少數酶對低溫敏感，如鳥肝丙-酮酸羧化酶25℃穩定，低溫下失活，過氧化氫酶要在0℃～4℃保存，冰凍則失活，羧肽酶反復凍融會失活等。
⑵制成干粉或結晶保存：蛋白質和酶固態比在溶液中要穩定的多。固態干粉制劑放在干燥劑中可長期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶與蛋白質含水量大于10％，室溫低溫下均易失活，含水量小于5％時，37℃活性會下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化學活性，含水量要小于3％。此外要特別注意酶在凍干時往往會部分失活。
⑶在保護劑下保存：很早就有人觀察到，在無菌條件下，室溫保存了45年的血液，血紅蛋白僅有少量改變，許多酶仍保留部分活性，這是因為血液中有蛋白質穩定的因素，為了長期保存蛋白質和酶，常常要加入某些穩定劑：例如：①惰性的生化或有機物質：如糖類、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩定的疏水環境。②中性鹽：有一些蛋白質要求在高離子強度（1 mol/L～4mol/L或飽和的鹽溶液）的性環境中才能保持活性。zui-常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用時要脫鹽。③巰基試劑：一些蛋白質和酶的表面或內部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時可加入半胱氨酸或巰基乙醇。
總之，對樣品的保存必須給以只夠的重視，一些常用酶的保存條件可參見《生物化學制備技術》（蘇拔賢主編）一書中的"一些酶保存的條件和穩定性"表，其他各種生物大分子和生物制劑的保存條件，可查閱有關的文獻和酶學手冊。
6. 分離純化方法的選擇
生物大分子能否率地制備成功，關鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個分離純化方法實驗條件的探索。選擇與探索的依據就是生物大分子與雜質之間的生物學和物理化學性質上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點可以看出，分離純化方案必然是千變萬化的。
制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下：① 以分子大小和形態的差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。② 以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結晶等。③ 以電荷差異為依據的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④ 以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析等
