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植物組織樣本的前處理方法 古朵新聞√
發(fā)布時(shí)間：2020-08-03瀏覽次數(shù)：1221返回列表
植物DNA的提取和純化是植物基因工程研究的基礎(chǔ)操作。實(shí)施分子標(biāo)記、基因圖譜、基因指紋圖譜、基因文庫(kù)構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析、DNA重組、RAPD（隨機(jī)引物多態(tài)性DNA）、RFLP（限制性酶多態(tài)性）、基因分離及遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定等都以提取DNA為前提。
目前，對(duì)從植物組織中提取DNA方法的要求是：簡(jiǎn)便、有效、快捷以及經(jīng)濟(jì)。與動(dòng)物組織相比，植物組織含有較多的多糖和其他次生代謝產(chǎn)物（酚、酯、萜、色素等），這給高質(zhì)量的DNA提取帶來(lái)較多的困難。尤其是多糖成分是影響DNA純度zui常見的問題。如何做到既去除這些污染物又能相對(duì)保持高的產(chǎn)量，并且能簡(jiǎn)捷有效地提純，一直是植物生物技術(shù)研究者探索的問題。
對(duì)于普通的植物（低酚、低酯、低糖等）如：水稻、白菜、莧菜、南瓜、黃瓜、西紅柿、上海青、菠菜、筍瓜、冬瓜、蓮藕、山藥、竹筍等；我們可以選用普通植物DNA提取試劑盒（磁珠法）試劑
對(duì)于多糖、多酚類植物（香蕉、西瓜、蘋果、梨等果肉，紅薯、馬鈴薯等塊莖，棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人參、曼陀羅、向天果、射干、桔梗、滿山紅、金雞納霜等藥用植物）可以選用多酚植物DNA提取試劑盒（磁珠法）試劑，針對(duì)類似的植物我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的優(yōu)化，可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以葉片為例，葉片需先剪碎成小塊，以便放入1.5ml離心管。zui佳樣本的長(zhǎng)度應(yīng)在1cm 以下。重量不超過(guò)250mg，推薦使用50mg，如果是植物種子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。
植物組織樣本的前處理方法：
一、勻漿介質(zhì)一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS），客戶可根據(jù)樣本及測(cè)定方針的狀況自行設(shè)定濃度，目的是堅(jiān)持樣本的等滲環(huán)境。
二、組織勻漿的制備
1、取組織塊（0.2g～0.5g）可到 5～10mg 在嚴(yán)寒的 PBS 中漂洗，濾紙拭干，稱重，放入 5ml 的勻漿管中。
2、按重量 (g)：體積 (ml)=1:4 的比例參與 4 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下，用眼科小剪趕快剪碎組織塊。
3、勻漿的方法：手工勻漿，機(jī)器勻漿。
① 手工勻漿：左手持勻漿管將下端刺進(jìn)盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿筆直刺進(jìn)套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 分鐘），充沛研碎，制成 20% 的勻漿液。
② 機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī) 10000～15000 轉(zhuǎn) / 分 上下研磨制成 20% 組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間 10 秒 / 次，空隙 30 秒，接連 3～5 次，在冰水中進(jìn)行，可適當(dāng)延伸勻漿時(shí)間），
4、將制備好的 20% 勻漿液用一般離心機(jī)或低溫低速離心機(jī) 4000 轉(zhuǎn) / 分左右，離心 10～15 分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定.
三、樣本保存
植物組織樣本暫時(shí)不測(cè)定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中心如不重復(fù)凍融，-20 ℃ 以下可保存三個(gè)月，-70 ℃ 以下可保存六個(gè)月。 制備好的勻漿液主張不要凍存，當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定，如放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)相關(guān)酶活會(huì)有所下降，部分方針 4 ℃ 可存放 3～5 天（如 SOD 要存放 2～3 天，MDA 可存放 3～5天，總蛋白測(cè)定可存 5～7 天
