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古朵生物:分子實驗中常用生化試劑的作用原理匯總
發布時間：2019-11-11瀏覽次數：1275返回列表
知道原理對實驗出問題時分析很有益，所以列出來一起分享！
1．溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。
2．NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。
3. 3mol／L NaAc（pH4.8）溶液： NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。
4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中Z常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的Z終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，Z后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。
5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至Z終濃度達0.1～0.25mol/L？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯fang抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較hao效果。
7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。
8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA？采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其Z終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。
9．抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯fang較好？酞與氯fang是非性分子，水是性分子，當蛋白水溶液與酚或氯fang混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯fang擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯fang有機溶劑比重更大，保留在Z下層。作為表面變性的酚與氯fang，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯fang的變性作用不如酚效果hao，但氯fang與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯fang效果Z好。經酚一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯fang是互溶的，可用氯fang第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯fang混合（1:1）使用。
10．為什么用酚與氯fang抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯fang與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯fang與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯fang與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。
11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，Z好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月沉淀回收質粒的時候省去酚和氯fang抽提，只做乙醇沉淀行嗎?
請看一下他們得作用！用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優點：1.有效變性蛋白質；2抑制了DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯fang的作用？氯fang：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。Z后用氯fang抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯fang中）用酚-氯fang抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯fang中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。
