實(shí)驗(yàn)室常見的支原體檢測方法你了解嗎?

發(fā)布時(shí)間：2019-02-11瀏覽次數(shù)：1491返回列表

支原體是一類能自我復(fù)制的zui小的原核生物，可透過一般過濾膜且對抗生素具有一定耐藥性，是原代細(xì)胞跟傳代細(xì)胞的常見污染物，其會(huì)改變細(xì)胞的 DNA、RNA 及蛋白表達(dá)。

支原體污染嚴(yán)重危害科研學(xué)者們的勞動(dòng)成果，早發(fā)現(xiàn)早處理，把損失降到zui低。《藥典三部 2015 版》-3301 支原體檢驗(yàn)-要求應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA 染色法），也可采用檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)認(rèn)可得其他辦法。這里筆者來簡單介紹一下目前實(shí)驗(yàn)室常見的支原體檢測方法：

1.培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是通過將待檢測樣品先接種到支原體液體培養(yǎng)基中大量繁殖，然后再轉(zhuǎn)接種到支原體固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后（大約一個(gè)月），如果固體培養(yǎng)中出現(xiàn)典型的支原體菌落，則說明待測樣品有支原體污染。

2、RD-RCA 恒溫法（MycoBlue Mycoplasma Detector）

吸取 1 ul 細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到反應(yīng)體系中，孵育 1 小時(shí)，若細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染，支原體 DNA 保守系列會(huì)被等溫 DNA 聚合酶特異性擴(kuò)增，使得反應(yīng)液由紫色變成天藍(lán)色。肉眼可觀察。

3.熒光染色法（Mycoplasma Stain Assay Kit）

該方法主要是能與 DNA 特異性結(jié)合的熒光染料 Hoechst33342 或 Hoechst33258，可使支原體內(nèi) DNA 著色，染色后可用熒光顯微鏡觀察。

4.酶活法（TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit）

     支原體溶解時(shí)釋放出來的酶與 TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit 中提供的底物發(fā)生催化反應(yīng)，將 ADP 轉(zhuǎn)化成 ATP，而 ATP 含量的上升，能通過生物發(fā)光化學(xué)反應(yīng)檢測，并通過分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)，從而達(dá)到檢測支原體的目的。

5. PCR 法（Genloci-Mycoplasma Detection Kit）

     利用對支原體基因組中保守的編碼域序列進(jìn)行 PCR 檢測的方法來進(jìn)行支原體檢測的。

除此之外還有相差顯微鏡法和電鏡掃描法，不過，因其限制因素較大，在此不進(jìn)行說明。
zui后，單獨(dú)使用目前市場上任何一種支原體檢測試劑盒，都無法做到準(zhǔn)確。嚴(yán)格的支原體檢測，應(yīng)至少使用二種及以上檢驗(yàn)方法來確定檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。

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