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淺談動物疫病抗體ELISA檢測技術
發布時間：2017-12-04瀏覽次數：1497返回列表
ELISA中文全稱是酶聯免疫檢測吸附試驗， 其核心是抗原抗體固相化及抗原抗體酶標記技術， ELISA檢測方法間接法、 夾心法、 阻斷法等多種檢測方法，其不同的檢測方法各有優劣。同時， 其他的產品組份及操作細節同樣影響著終的試驗結果。
1.ELISA試劑盒的選擇
1.1 產品的技術參數選擇一個ELISA產品先需要了解的是其技術參數，大致包括以下幾個方面。 產品的有效期： 目前市面上的ELISA試劑盒大多均為2-8℃保存，有效期12個月。 產品的包裝規格：常用的包裝規格是96T*1/2/5塊板。產品的適用性： 比較理想的產品是同時可以檢測針對同一病種的不同動物血清樣品。
1.2 產品的性能指標ELISA產品屬于免疫檢測試劑，其基礎的性能指標就是： 敏感度、 特異度、（批內/批間） 重復性， 在此基礎上進一步評價的性能指標有：約登指數、 陽性預測值、 陰性預測值、 陽性似然比、陰性似然比、 粗一致性、 調整一致性、 95％置信區間等， 但是需要注意的是這些性能指標都是建立在金標準的基礎上的。如果只是兩種檢測方法的對比就需要做一些相關性統計分析， 如卡方檢驗、 t檢驗、 F檢驗、 Kappa值等， 也可以計算出一些相關性的性能指標。
1.3 產品的客戶體驗產品的客戶體驗是在客戶使用產品的過程中除了產品性能之外的一些使用的感受。如： 產品包裝的外觀設計、 產品在運輸后的完整性及整潔性、產品組份的標識是否完整及清楚、 不同產品組份是否容易區分、 產品操作說明是否簡單易懂、操作步驟是否簡單、 結果判斷是否容易、 數據分析方法及工具等。這些細節也會影響到使用者對一個產品的整體印象。
2.樣品的采集、 處理及保存
2.1樣品的采集ELISA試劑盒一般是采用動物的血清或血漿進行檢測。在血液標本采集的過程中先是采集的準備工作。 血液采集的時間在不影響生產工作的基礎上選擇血液樣品質量好、 采集比較容易的時段，樣品采集數量或比例的計劃， 樣品采集前的防護工作， 采集器具的準備，如注射器或采血管的容量、 是否需要抗凝血， 采集的數量、 樣品采集后裝在什么容器里，如何保存、 標識及記錄等。 這些都是需要結合實際的檢測需求進行準備。
2.2 樣品的處理樣品的處理主要指血清或血漿的分離。 在血清或血漿分離過程中需要注意以下問題：將分離的血清或血漿需要另外一個容器存放， 在更換容器的過程中注意保持編號或記錄的完整及正確。 血清可以離心分離也可以冷藏自然析出，需要注意的是在紅細胞與血清未分離前不可以冷凍，因冷凍后血液中紅細胞會破裂導致溶血， 影響后面實驗的效果。 血漿分離直接離心即可，但是注意離心機的轉速和離心的時間， 如果過度離心也會導致紅細胞破裂。
2.3 樣品的保存如果一周之內進行檢測， 將分離的血清或血漿樣品存放于2-8℃待檢即可。 如果一周之內不進行檢測可將樣品進行-20℃冷凍保存， 若是長期存放可保存于-40℃。 但是需要注意的是反復凍融會導致血清或血漿中的抗體部分失活，所以根據實驗的需要可以將樣品進行小體積分裝后保存。
3. 實驗操作
3.1 樣品的稀釋樣品稀釋是ELISA實驗過程中操作影響大的部分之一，因為樣品稀釋大多是手工操作完成。 不同的檢測原理使用的血清濃度有差異， 血清稀釋倍數從1：1到1：200不等。阻斷法一般使用的血清濃度比較高， 其次是夾心法， 間接法使用的血清濃度比較低。血清稀釋先是采用正確的稀釋倍數和使用正確的樣品稀釋液， 另外還要注意混勻和防止不同樣品質檢交叉污染。如果樣品量比較大可以使用稀釋版進行稀釋， 如果稀釋倍數比較高可以采用分步稀釋的方法。 避免進行長時間的孔內稀釋，因為這樣會造成前后樣品反應時間的差異， 影響到板內的均一性。
3.2 樣品或液體的添加樣品或液體的添加其實就是將液體從樣品管、 稀釋板或加樣槽中轉移到包被板中。這一步操作關鍵是正確及規范正確使用移液器， 需要注意的是在將液體加至包被板的微孔中時避免產生氣泡或將液體加在管壁上部，另外在添加液體后避免用微旋振蕩器進行混勻， 此細節針對不同工藝的產品會產生不同程度的影響。
3.3 孵育孵育就是抗原抗體反應的過程。 不同的產品所設計的孵育溫度有25℃、 37℃等，孵育時間有10、 15、 30、 60分鐘等。 先是要確保孵育的溫度和時間正確無誤，另外需要注意的是， 孵育時防止微孔板被的液體蒸發產生濃縮效果， 使整個實驗本底升高，為了避免這個問題通常采用濕盒或封板膜。 另外就是需要考慮孵育時包被板內的液體受熱的時間、 速度及均一度。
3.4 洗板液的主要成分是表面活性劑， 其主要的作用是洗掉沒有參與反應的或非特異性結合的物質。洗板也是ELISA實驗操作中影響比較大的一步，但是現在大多使用洗板機， 其認為操作帶來的影響就大大減小。 如果采用手工洗板方法需要注意以下幾點：洗滌液的稀釋倍數及稀釋所使用的溶劑， 添加洗滌液的體積， 浸泡時間和洗板次數。每一個因素都會直接影響到試劑的性能。
3.5 終止反應終止液的成份主要取決于酶及底物的成份， 常用的終止液有氫氧化鈉、氟化氫或硫酸， 這些液體都具有很強的腐蝕性， 使用時要注意安全，如果濺到眼睛或皮膚需要及時處理。 在實驗過程中要在正確的時間進行終止， 終止之后孔內液體的顏色相對比較穩定，但是也會緩慢的變化， 有時候孔內會緩慢產生沉淀同時孔內顏色變淺， 需要及時進行讀值。
4.數據讀取及分析
4.1 數據的讀取ELISA實驗數據的讀取需要使用酶標儀。酶標儀在使用之前需要預熱30分鐘以上， 讀數時注意選擇正確的波長。酶標儀讀數常采用單波長或雙波長兩種方式， 如果條件允許盡可能選擇使用雙波長。 因為雙波長讀數可以消除孔內非特異性反應所帶來的對發射光的吸收值，如果使用單波長， 則這些影響因素可能對檢測結果帶來影響。
4.2 數據的分析實驗數據的分析分為COV值的計算及結果判斷和數據的統計分析兩個部分。 COV值的計算方法不同試劑盒差異較大， 有直接采用固定值或臨界對照、陰性對照加上或乘以一個系數、 陽性對照乘以一個系數或者計算標準曲線等， 總之嚴格參照說明書的要求進行結果判斷，有些計算方法或公式在酶標儀上無法直接設置的就需要進一步電腦換算。 另外， 有些試劑盒還需要設置空白對照［1］，需要將樣品孔的吸光度值減去空白對照孔后進行COV值計算。數據的統計分析主要根據實驗目的可以進行板內重復性分析（一般是計算變異系數）， 批間差異分析 （一般進行相關性分析），不同產品的檢測結果差異分析 （計算Kappa值或進行卡方檢驗），實驗數據的長期觀察分析 （需要進行畫圖進行趨勢分析） 等。
5. 總結ELISA檢測技術看似比較簡單，但是每一個部分、 步驟或因素均可能影響到整體的實驗結果， 如果展開將是一個比較大的課題，在此本人只是將一些關鍵的環節點到為止。 ELISA檢測的很多細節還需要在實際工作中不斷的摸索、思考和總結。
