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比色法和分光光度法的基本知識
發布時間：2017-12-12瀏覽次數：1556返回列表
一、 光的特性
光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續的微粒和連續的波動性。波長和頻率是光的波動性和特征，可用下式表示：
λ＝C/V
式中λ為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。Ｖ為頻率，即每秒鐘振動次數。Ｃ為光速等于299770千米／秒。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長的電磁波，列成表1-1所示的波譜圖。 分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之間。其中200nm－400nm為紫外光區，400nm－760nm為可見光區，760nm－10,000nm為紅外光區。
二、光的互補色
假如兩種色光 ( 單色光或復色光 ) 以適當地比例混合而能產生白色感覺時，則這兩種顏色就稱為“互為補色”。 非發光物體的顏色 ( 如顏料 ) ，主要取決于它對外來光線的吸收和反射，所以該物的顏色與照射光有關。一般把物體在白晝光照射下所呈現的顏色稱為該物體的顏色。如果將白晝光照射在黃藍兩種顏色混合后的表面時．因黃顏料能反射白光中的紅、橙、黃和綠四種色光，而藍色光能吸收其中的紅、橙和黃三種色光，結果使混合顏料顯示綠色。這種顏色的混合與色光的加色混合不同，
三、光的選擇性吸收
物質對光的吸收是物質和光能相互作用的一種形式。由于光的波粒二象性只有當入射光的能量同吸光物質的基態和激發態能量差相等時才會被吸收，而物質的基態和激發態是由物質的原子結成和原子間相互作用決定的，不同的物質的能態不同，對光的選擇性吸收也就不一樣。所以物質對光具有選擇吸收性。
要研究光的選擇性吸收，先必須搞清楚其產生的機理。
原子是由質子和核外電子組成的，核外電子以不同速度在質子周圍不同軌道上旋轉，每個軌道的能級是不一樣的。如同衛星圍繞地球轉的情況是相似的。同時，每個軌道又有方向不同的亞軌道，而同一軌道的不同亞軌上的能量也是不相同的。當電子的運動軌道改變都會伴有吸收和釋放能量。所以不同的能量變化有不同的吸收光譜。分子的情況較為復雜，除了電子的躍遷外還有分子的轉動和振動躍遷、分子中原子的轉動和振動躍遷。詳細情況如1圖所示：
當某一光線和某一能級差相同時就會發生特異性吸收。因此不同的物質有不同的吸收光譜。
分光光度法對物質的定量分析，就是建立物質對光的選擇性吸收與物質本身物性有關基礎上，從而能在適當的情況下，可以不進行分離就在混合物中進行單組分或多組分的測定。
在實際定量分析中，待分析物一般都是混合物，其中以溶液為主。因此，溶劑效應對物質吸收帶影響是個很重要的問題，特別是紫外區的吸光譜。溶液中的吸收光譜和物質氣態光譜是不同的，在非性溶劑中所得的光譜接近于氣態光譜。而性溶劑對溶質吸收光譜的影響大。下圖可以明顯顯示出溶劑效應，庚烷性小，其吸收光譜改變少，而乙醇性大，吸收光譜產生了重要改變。這點對臨床檢驗工作有重要影響。例如：NADH是檢驗工作中常用的底物，要計算K值時要用水溶液的吸光系數，而不要用其他體系的吸光系數。
要研究光的選擇性吸收，先必須搞清楚其產生的機理。
原子是由質子和核外電子組成的，核外電子以不同速度在質子周圍不同軌道上旋轉，每個軌道的能級是不一樣的。如同衛星圍繞地球轉的情況是相似的。同時，每個軌道又有方向不同的亞軌道，而同一軌道的不同亞軌上的能量也是不相同的。當電子的運動軌道改變都會伴有吸收和釋放能量。所以不同的能量變化有不同的吸收光譜。分子的情況較為復雜，除了電子的躍遷外還有分子的轉動和振動躍遷、分子中原子的轉動和振動躍遷。詳細情況如1圖所示：
當某一光線和某一能級差相同時就會發生特異性吸收。因此不同的物質有不同的吸收光譜。
分光光度法對物質的定量分析，就是建立物質對光的選擇性吸收與物質本身物性有關基礎上，從而能在適當的情況下，可以不進行分離就在混合物中進行單組分或多組分的測定。
在實際定量分析中，待分析物一般都是混合物，其中以溶液為主。因此，溶劑效應對物質吸收帶影響是個很重要的問題，特別是紫外區的吸光譜。溶液中的吸收光譜和物質氣態光譜是不同的，在非性溶劑中所得的光譜接近于氣態光譜。而性溶劑對溶質吸收光譜的影響大。下圖可以明顯顯示出溶劑效應，庚烷性小，其吸收光譜改變少，而乙醇性大，吸收光譜產生了重要改變。這點對臨床檢驗工作有重要影響。例如：NADH是檢驗工作中常用的底物，要計算K值時要用水溶液的吸光系數，而不要用其他體系的吸光系數。
小結：
一、 光的特性
二、光的互補色
三、光的選擇性吸收
