在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)516nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)O52F熒光,從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氮水平。本試劑盒可以用于各種真核培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)。...

檢測(cè)方法：

●熒光分光光度計(jì) ● 熒光酶標(biāo)儀 ● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類(lèi)型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀,激發(fā)波長(zhǎng)490±10 nm,發(fā)射波長(zhǎng)510 ±10 nm,或者按照FITC熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

● PBS ● HBSS(不含酚紅) ● 移液器 ● 離心機(jī) ● 熒光專(zhuān)用黑色96孔板

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 熒光探針標(biāo)記后,一定要洗凈殘余未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針,否則導(dǎo)致背景較高。

● 探針標(biāo)記完畢并洗凈殘余探針后,可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描,以確認(rèn)探針的標(biāo)記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標(biāo)記后到測(cè)定所用的時(shí)間,以減少各種可能的誤差。

● O52染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 使用前,先將本品回溫至室溫,并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)短離心使DMSO 溶液集中于管底。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類(lèi)而異,根據(jù)不同樣本的實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整,在每次實(shí)驗(yàn)前,請(qǐng)先根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求、細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞的膜通透性等進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 酚紅對(duì)O52熒光探針的檢測(cè)有干擾,需避免。

● 染色后立即進(jìn)行分析。

● 以下步驟僅做為參考,稀釋比例和孵育時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況來(lái)調(diào)整。比如,對(duì)于某些細(xì)胞,如果發(fā)現(xiàn)未被刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng),可降低探針濃度。如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱,可升高O52探針濃度,以提高檢測(cè)的靈敏度。另外,探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整,孵育溫度在4℃-37℃內(nèi)調(diào)整。

● 必須使用熒光檢測(cè)專(zhuān)用的黑色96孔板。

使用方法：

1、探針染色工作液配制：

根據(jù)樣本數(shù)量,用HBSS將O52熒光染料100倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】:

● 建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對(duì)母液進(jìn)行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。

● 實(shí)驗(yàn)前,使用HBSS或PBS稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度,一般染色終濃度100-1000倍稀釋。

● 可以用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋探針,不可以用含血清的培養(yǎng)基稀釋。

● 為了降低過(guò)度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和線粒體毒性,在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外,濃度過(guò)高也可能造成非特異性染色,對(duì)其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、細(xì)胞探針標(biāo)記

2.1 原位標(biāo)記：僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1)培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板準(zhǔn)備細(xì)胞樣本。

2)待細(xì)胞生長(zhǎng)到合適豐度,去除細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗細(xì)胞一次。

3)加入適量體積37℃預(yù)熱的含O52探針工作液。

【注】:

● 加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于6孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的O52探針不少于1mL，96孔板加入100-200μL。

● 也可以將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上,加入合適培養(yǎng)基,使其爬片生長(zhǎng)。

4)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)于生長(zhǎng)狀態(tài)下孵育20～40分鐘(具體孵育時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而定,需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化)。

5)移除染色液,用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞3次。以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O52探針。

【注】:

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長(zhǎng)染色時(shí)間。

● 也可以用HBSS/無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。

6) 加入200μL HBSS緩沖液。

【注】:

● 也可以用PBS/細(xì)胞培養(yǎng)基。

7)熒光顯微鏡(含合適濾片)或熒光酶標(biāo)儀下觀察。最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/516nm。

2.2 收集后標(biāo)記：懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞消化處理

1)離心,吸除上清培養(yǎng)基。

2)用PBS洗細(xì)胞一次。

3)細(xì)胞收集后重懸浮于稀釋好的37℃預(yù)熱的O52探針工作液中，細(xì)胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL。

4)于生長(zhǎng)狀態(tài)下37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20-30分鐘（具體時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而定，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。

5)離心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重懸細(xì)胞，洗滌3次。以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O52探針。

6)用HBSS/PBS/無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7)用熒光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488nm/516nm。

【注】:

● 對(duì)于懸浮細(xì)胞,也可將細(xì)胞貼附于經(jīng)細(xì)胞粘合劑處理過(guò)的蓋玻片上,然后使用類(lèi)似于貼壁細(xì)胞的方法進(jìn)行染色。

● 如果需要蓋玻片上固定化的細(xì)胞,那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸(poly-D-lysine)包被載玻片或蓋玻片。

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長(zhǎng)染色時(shí)間。

3、檢測(cè)：

1)對(duì)于原位標(biāo)記探針的樣品可以用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，或者用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡，直接拍照分析（需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件）。

2)或收集細(xì)胞后標(biāo)記探針然后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3)對(duì)于收集細(xì)胞后標(biāo)記探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析也可以（需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件）。

4)使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，520nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。

探針O52的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)。

5) 熒光強(qiáng)度強(qiáng)，活性氮含量高。

【注】:

● 如果用顯微鏡拍照分析的話，需要細(xì)胞分布均勻。

● 要結(jié)合明場(chǎng)的照片具體分析。如果細(xì)胞分布均勻算固定面積熒光強(qiáng)度。成像時(shí)中心和四周有差異時(shí)，一般將四周剪切掉也可以。如果細(xì)胞分布不勻，需要找到細(xì)胞分布勻稱(chēng)的視野，一個(gè)視野一個(gè)視野找。如果要用圖片做結(jié)果，就要平行做多個(gè)圖片，作分析，統(tǒng)計(jì)，每張都要求熒光分布盡量一致。

● 為了去除雜光的影響，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)統(tǒng)計(jì)熒光的強(qiáng)度范圍，將信號(hào)過(guò)弱的背景雜光去除掉。

● 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數(shù)均要一致。

● 對(duì)于不同情況熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要或參考文獻(xiàn)。可以算等面積的平均強(qiáng)度；也可以算閾值高于一定值的平均強(qiáng)度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據(jù)課題需要選擇合適的測(cè)量統(tǒng)計(jì)方法。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 活性氮結(jié)果如何分析？

RNS是多種物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，不像某一單一活性氮指標(biāo)，無(wú)法檢測(cè)其絕對(duì)的含量，只能通過(guò)設(shè)置參照樣本，以參照樣本的倍數(shù)來(lái)反映目標(biāo)樣本相對(duì)含量變化，這個(gè)“相對(duì)”是針對(duì)參照的。分析結(jié)果是定性的，也是沒(méi)有單位的，因?yàn)樗举|(zhì)上是一個(gè)比值（目標(biāo)/參照）。反映的是模型樣本通過(guò)具體的干預(yù)措施（如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其RNS的變化，測(cè)定其RNS是增加或者降低了。

● 熒光照片如何分析？

需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件。RNS表達(dá)水平直接通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱和分布范圍來(lái)體現(xiàn)。

有的顯微鏡掃描下來(lái)的圖像本身就可以測(cè)面積和強(qiáng)度，可以同時(shí)測(cè)不同顏色的熒光強(qiáng)度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉(zhuǎn)換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行分析。

要結(jié)合明場(chǎng)的照片具體分析。如果細(xì)胞分布均勻可以算固定面積熒光強(qiáng)度。成像時(shí)中心和四周有差異時(shí)，一般將四周剪切掉也可以。如果細(xì)胞分布不勻，需要找到細(xì)胞分布勻稱(chēng)的視野，一個(gè)視野一個(gè)視野找。

如果要用圖片做結(jié)果，就要平行做多個(gè)圖片，作分析，統(tǒng)計(jì)，每張都要求熒光分布盡量一致。

為了去除雜光的影響，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)統(tǒng)計(jì)熒光的強(qiáng)度范圍，將信號(hào)過(guò)弱的背景雜光去除掉。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數(shù)均要一致。

對(duì)于不同情況熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要或參考文獻(xiàn)。可以算等面積的平均強(qiáng)度；也可以算閾值高于一定值的平均強(qiáng)度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據(jù)課題需要選擇合適的測(cè)量統(tǒng)計(jì)方法。

● 熒光照片效果不好？

熒光拍照存在很多變量，每一個(gè)變量都會(huì)嚴(yán)重影響拍照效果。

熒光拍攝條件：拍攝環(huán)境、顯微鏡品牌和激發(fā)熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強(qiáng)度。

熒光衰減：熒光物質(zhì)的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時(shí)內(nèi)拍攝和8小時(shí)后拍攝，熒光效果完全不同。

最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優(yōu)。