HR0019-50T 膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒
- 產(chǎn)品/服務(wù)：HR0019-50T 膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒
- 型 號(hào)：HR0019-50T
- 單 價(jià)：面議
- 更新日期：2023-06-01
- 有效期至：長(zhǎng)期有效
- 瀏覽次數(shù)：891
本產(chǎn)品是一種高效的高產(chǎn)膜蛋白提取試劑盒。提供全套試劑，適用于從細(xì)胞和動(dòng)物組織提取膜蛋白和胞漿蛋白。提取國(guó)產(chǎn)簡(jiǎn)單方便。本試劑盒提取的蛋白可用于WB、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒不含...
使用方法：
提取液準(zhǔn)備
每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，2μL蛋白穩(wěn)定劑，混勻后置冰上備用。
每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
【注】：
● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加過(guò)蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。
● 提取液A在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。
● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。
細(xì)胞蛋白提取
1、取5-10×106個(gè)以上細(xì)胞，在4℃，500×g條件下離心2-3 分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。
【注】：
● 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，由于膜蛋白含量較少，需要較多細(xì)胞才能保證得率。
2、用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
3、細(xì)胞樣品中加入200μL冷的試劑A，高速渦旋振蕩5 秒，置2-8℃振蕩30分鐘-1小時(shí)。
【注】：
● 此步驟必須在2-8℃條件振蕩。
● 振蕩時(shí)用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體稍微晃動(dòng)即可。
● 無(wú)2-8℃振蕩條件也可不振蕩，置2-8℃靜置，稍微延長(zhǎng)提取液處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。
● 提取液A處理后細(xì)胞沉淀應(yīng)明顯減少，否則延長(zhǎng)處理時(shí)間。
● 此步如果細(xì)胞裂解不充分，下步有大量細(xì)胞沉淀，請(qǐng)延長(zhǎng)2-8℃振蕩裂解時(shí)間至40分鐘或更長(zhǎng)，直至細(xì)胞充分裂解。
4、再次高速渦旋振蕩5秒，然后在4℃，13000×g條件下離心5分鐘。
5、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，37℃水浴10分鐘，37℃條件下2000×g離心3分鐘，此時(shí)溶液分為兩層（對(duì)著光線看），下層約為20-50μL。
【注】：
● 必須37℃水浴和離心。
● 沒(méi)有37℃離心條件可以不離心，延長(zhǎng)水浴時(shí)間至分層明顯即可。
6、小心收集上層，即為胞漿蛋白，下層為膜蛋白。
【注】：
● 此時(shí)得到的膜蛋白樣品即可用于下游實(shí)驗(yàn)。在下層膜蛋白中加入50-200μL冰冷的試劑C溶解膜蛋白，充分混勻，即可用于下游應(yīng)用。
● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。
● 置4℃靜置至管底透明膠狀物完全溶解。
● 下面的第7-8步驟可以不做，如果需要進(jìn)一步提高膜蛋白純度，可以選做，但是會(huì)降低膜蛋白的回收率，損失一部分膜蛋白。
7、用150-200μL冰冷的試劑B稀釋下層膜蛋白部分，混勻后冰浴2分鐘，然后37℃水浴5-10分鐘，37℃條件500-2000×g離心3分鐘，此時(shí)溶液分為兩層，下層約為20-50μL。
8、小心移除上層，用50-200μL冰冷的試劑C溶解下層，即得膜蛋白。
【注】：
● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。
● 置4℃靜置至管底透明膠狀物完全溶解。
9、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。
【注】：
● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。
● 蛋白樣品-80℃存放一年沒(méi)問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。
組織蛋白提取
1、取適量組織樣本用手術(shù)剪刀盡可能剪碎，加入冷的蛋白提取液A，用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體，將勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。
2、按照細(xì)胞蛋白的提取方法的第2步驟往下操作即可。
常見(jiàn)問(wèn)題分析：
● 蛋白濃度低？
膜蛋白豐度較低，需要保證足夠的細(xì)胞量，在條件允許的情況下，盡可能增加細(xì)胞量。處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全,導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑A的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理,沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
● 用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford 法,因?yàn)樵噭〢 中含有干擾Bradford 法的組份,導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系,則可以用Bradford 法定量。
● 提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份,不破壞蛋白的結(jié)構(gòu),沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞,蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。
● 膜蛋白電泳沒(méi)有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。
蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading Buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時(shí)最好采用低電壓低電流電泳。
膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。
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