DNA片段化試劑是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價(jià)格，深為用戶稱道，了解更多DNA片段化試劑等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品請(qǐng)聯(lián)系我司咨詢訂購(gòu)。...

特別提示：包括DNA片段化試劑在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DNA片段化試劑
英文名稱：DNA Fragmentation Reagent
產(chǎn)品貨號(hào)：WH0207
產(chǎn)品規(guī)格：24次|96次

本制品為高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建配套試劑盒，用于文庫(kù)構(gòu)建前的大片段DNA片段化。模塊利用時(shí)間依賴型酶促反應(yīng)的原理，根據(jù)不同的作用時(shí)間將雙鏈DNA隨機(jī)切割成200~500 bp的片段，所得片段為平末端雙鏈DNA片段，5"端基團(tuán)含有5"-P，3"端基團(tuán)含有3"-OH，可直接進(jìn)行后續(xù)的dA或adapter添加。通過本制品對(duì)雙鏈DNA隨機(jī)的切割，表明本產(chǎn)品不具堿基偏好性，且不同類型切割DNA片段的測(cè)序覆蓋率與機(jī)械切割一致。

適用范圍：為構(gòu)建NGS文庫(kù)制備片段化的雙鏈DNA。
適用樣本量：1ng~1μg DNA

產(chǎn)品特點(diǎn)：
·無需特殊儀器設(shè)備，通過酶促反應(yīng)簡(jiǎn)便快速的片段化雙鏈DNA。
·使用靈活，通過調(diào)整片段化時(shí)間，靈活調(diào)整DNA片段化長(zhǎng)度。
·反應(yīng)，單個(gè)反應(yīng)體系即可完成1ng～1μg DNA樣本的片段化。

產(chǎn)品組成：

組分	24次	96次
5×Frag Enzyme Mix	240μl	960μl
10×Frag Buffer	120μl	480μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存條件：-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融，保質(zhì)期為一年。

注意事項(xiàng)：（請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)）
1．操作過程請(qǐng)注意避免核酸樣品和產(chǎn)物之間的交叉污染。
2．請(qǐng)使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進(jìn)行試驗(yàn)。
3．試驗(yàn)開始前，請(qǐng)清潔操作臺(tái)，確保沒有RNA酶和DNA的污染。
4．進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增前，請(qǐng)確保PCR儀已經(jīng)調(diào)試好并處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
5．試驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，如果需要暫停試驗(yàn)，或者無需立即進(jìn)行下游試驗(yàn)。可根據(jù)說明書推薦將試驗(yàn)產(chǎn)物保存于-20℃并安排后續(xù)試驗(yàn)。

推薦使用的其他試劑：
1.DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑（WH0209-01/02)
2.adapter快速連接試劑（WH0201-01/02）
3.NGS文庫(kù)富集試劑（WH0210-01/02)

操作步驟：

一、試驗(yàn)準(zhǔn)備
1.在開始實(shí)驗(yàn)前，明確核酸的濃度及純度至關(guān)重要，推薦DNA上樣量為1ng~1μg。DNA需溶解于以下溶液中：去離子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：
?確定上樣DNA濃度至關(guān)重要，尤其在上樣量低于100 ng時(shí)。推薦使用Qubit、Picogreen或者其他染料法對(duì)DNA濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
?請(qǐng)確認(rèn)DNA溶液中不含陽(yáng)離子及螯合劑。如果DNA溶解于1×TE或不確定DNA溶液中的EDTA濃度，使用Agencourt AMPure XP磁珠進(jìn)行純化。
2.將各試劑置于冰上，5×Frag Enzyme Mix融化后用手指后輕彈混勻，不要渦旋。其余試劑可短暫渦旋混勻。

二、試驗(yàn)步驟
1.照下表設(shè)置PCR儀反應(yīng)程序。開啟熱蓋，熱蓋溫度設(shè)置為70度。

操作步驟	溫度	時(shí)間
1	4℃	1min
2	32℃	3-22min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：確切的片段化反應(yīng)時(shí)間需要根據(jù)DNA的實(shí)際上樣量進(jìn)行優(yōu)化。下表1中列出100ng DNA片段化所需的時(shí)間。用戶可以依據(jù)此時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。調(diào)整過程中，我們推薦額外設(shè)置一個(gè)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)3min以及一個(gè)縮短3min的對(duì)照，這樣有助于確定切割至所需片段大小時(shí)所需要的準(zhǔn)確反應(yīng)時(shí)間。

表1：片段化時(shí)間選擇表

	片段化時(shí)間（min)（32℃)
DNA主峰大小	200bp	300bp	400bp	500bp
100ngDNA上樣量	15	8	5	3.5

圖1.100ng大腸桿菌基因組DNA片段化圖譜（3～22 min）

2．在薄壁管中按下表配制反應(yīng)體系，冰上操作，各組分加入后，請(qǐng)輕柔吸打混勻，注意不要渦旋。

成分	用量（μl)
10×Frag Buffer	5
DNA樣本	X
Nuclease-Free ddH2O	（35-X)*
總體積	40

  *注：對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，請(qǐng)計(jì)算所需試劑的總體系并在此基礎(chǔ)上增加體系10%，以避免因溶液轉(zhuǎn)移過程中掛壁損失而造成分裝反應(yīng)數(shù)不足的問題。
3．向薄壁管中加入10μl 5×Frag Enzyme Mix，輕柔吹打6～8次，不要渦旋。
  注：此過程需一直處于冰浴中進(jìn)行。
4．將薄壁管短暫離心，收集溶液至管底后，立即轉(zhuǎn)移至4℃預(yù)冷的PCR儀中，啟動(dòng)步驟1中的反應(yīng)程序。
5．當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束，PCR儀溫度降至4℃后，將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

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名稱：CCK mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0219
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：rat
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.CCK mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時(shí)。某些組織對(duì)過度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
CCK的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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