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特別提示：包括adapter快速連接試劑（illumina)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：adapter快速連接試劑（illumina)
英文名稱：Fast Ligation Reagent
產品貨號：WH0201
產品規格：24次|96次

本制品是專門針對于illumina高通量測序平臺所優化的預混酶模塊。使用本模塊可以將3"端帶有dA尾的DNA片段與adapter進行快速連接。與常規方法比較，本模塊采用了一步法反應流程，BaiSeq Fragmentation/DNA末端修復/加dA尾試劑或BaiSeq DNA末端修復/加dA尾試劑反應后所獲得的片段后DNA，無需磁珠純化，可使用本模塊直接與adapter進行連接，省去了多步磁珠純化步驟，操作更加簡便，文庫轉化效率更高。適用樣本量：0.25ng～1μg DNA。

產品特點：
·無需磁珠純化，可直接將DNA adapter與帶有dA-Tailing的DNA片段連接。
·連接，可進行微量樣本的DNA adapter連接。

適用范圍：
將DNA adapter與3"端添加dA的DNA文庫片段的快速連接（如Fragmentation/DNA末端修復/加dA尾試劑或DNA末端修復/加dA尾試劑處理后的產物）

試劑盒組成：

組分	24次	96次
DNA Ligase	240μl	960μl
5×Ligation Buffer	500μl	2×1ml
Nuclease-Free ddH2O	1ml	2×1ml

保存條件：-25～-15℃保存，避免反復凍融，保質期為一年。

注意事項（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項）
1．操作過程請注意避免核酸樣品和產物之間的交叉污染。
2．請使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進行試驗。
3．試驗開始前，請清潔操作臺，并使用RNA酶及DNA清除試劑處理臺面，確保沒有RNA酶和DNA的污染。
4．進行文庫擴增前，請確保PCR儀已經調試好并處于穩定的狀態。
5．試驗前請仔細閱讀說明書，如果需要暫停試驗，或者無需立即進行下游試驗。可根據說明書推薦將試驗產物保存于-20℃并安排后續試驗。

操作步驟：

1．DNA片段經Fragmentation/DNA末端修復/加dA尾試劑或DNA末端修復/加dA尾試劑處理，完成A尾添加反應后，向此50μl反應體系中加入Y μl的adapter溶液，輕柔吸打混勻后置冰上。
  注意：本試劑盒中不含測序DNA adapter，推薦配合Single-Indexed Adapter（Illumina? Platforms) （WH0206)使用，為了達到較高的連接效率，我們推薦反應體系中DNA片段與adapter的摩爾比在10:1至200:1之間，詳見WH0206產品說明書。
2．按照下表所示各組分用量配制反應體系，并將配制完成的反應體系輕柔混勻后置于冰上。

成分	使用量
5×Ligase Buffer	20μl
DNA Ligase	10μl
Nuclease-Free ddH2O	（20-Y)μl

  注：對于多個樣品，請計算所需試劑的總體積并在此基礎上額外添加10%的試劑，以避免分裝過程中槍頭掛壁損失而導致試劑體積不足。
3．將此配制好的（50-Y）μl連接反應液加入至第1步準備的反應液中，輕柔吸打混勻，置于20℃中反應15min。
  注意：此步驟如果使用PCR儀進行反應，請不要啟動熱蓋。
4．向反應產物中加入0.8×體積（80 μl）Agencourt AMPure XP磁珠進行純化，具體步驟如下：
①將AMPure@XP磁珠置于室溫平衡20 min。
②渦旋使磁珠充分懸浮，加入80 μl Agencourt AMPure XP磁珠至步驟3溶液中，充分吸打混勻。
③室溫孵育5 min，將反應管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全貼壁后，用移液器吸棄上清。
④向反應管內加入200 μl 80%乙醇，輕輕震蕩混勻，洗滌磁珠，并用磁力架回收磁珠，棄上清。
⑤將含有磁珠的反應管置磁力架上，開蓋室溫放置5~10 min，至晾干。
  注：不要過分干燥磁珠，否則會造成得率降低。
⑥加入25 μl 10mM Tris-HCl （pH 8.0)至離心管內并使用移液器輕輕吸打磁珠至充分懸浮。將反應管放置于磁力架上1~2 min，只使磁珠完全貼壁后，轉移約20 μl上清至新的離心管中，用于后續的PCR富集實驗。
  注：如果需要對DNA片段大小進行選擇，則請參照DirectFast DNA Library Kit （illumina) （WH0203)說明書中片段分選步驟進行操作。如果連接產物無需進行PCR富集，可在步驟g)中加入12.5 μl的10mM Tris-HCl （pH 8.0)洗脫DNA，并轉移10 μl純化后的DNA用于后續的試驗反應。如不立即使用，請將樣品凍存于-20℃保存。

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名稱：Androgenbinding protein/ABP mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0057
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.Androgenbinding protein/ABP mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
Androgenbinding的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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