北京百奧萊博供應(yīng)的活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒用于科研目的，我公司的活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(Calcein-AM/EthD-I雙染法)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(Calcein-AM/EthD-I雙染法)
產(chǎn)品貨號：HR8279
產(chǎn)品規(guī)格：500T|1000T

活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒是采用Calcein-AM/EthD-I 雙染細(xì)胞的方法染色活細(xì)胞和死細(xì)胞。
Calcein-AM 是一種可對活細(xì)胞進行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM 由于在Calcein的基礎(chǔ)上加強了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為Calcein留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是zuì適合作為熒光探針去染活細(xì)胞的，因為它的細(xì)胞毒性很低。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。Calcein-AM僅對活細(xì)胞染色。
作為核染色染料的EthD-I (Ethidium Homodimer 1)不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA 雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：488nm，528nm，發(fā)射：617 nm)，因此EthD-I 僅對死細(xì)胞染色。
由于Calcein-DNA和EthD-I-DNA 都可被490 nm 激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm 激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。根據(jù)以上特點，Calcein,AM和EthD-I經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

儲存條件：試劑AB-20℃避光干燥保存；試劑C 2-8℃保存。
有效期：一年。

※ ※ ※ 使用前請仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書 ※ ※ ※
使用限制：本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。
產(chǎn)品更新：我公司會更新或升級產(chǎn)品，以優(yōu)化和增強其使用性能，產(chǎn)品說明書會進行相應(yīng)的版本更新。使用產(chǎn)品時，請參照隨產(chǎn)品附帶的說明書，不要參照網(wǎng)上下載的說明書，可能是不同的版本。需要zuì新電子版說明書時可以在收到產(chǎn)品后發(fā)郵件索取。
使用安全：使用時需要合適的實驗室外套，一次性手套。避免皮膚或粘膜與試劑接觸。如果試劑不小心接觸皮膚或眼睛，應(yīng)立即用水沖洗。

注意事項：
● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。
● 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。
● 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。
● zuì好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并徹底清除殘留清潔劑。
● 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。
檢測方法：
流式細(xì)胞儀
熒光顯微鏡
激光共聚焦
樣本類型：
● 懸浮細(xì)胞
● 貼壁細(xì)胞
試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：
儀器
● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ●離心機 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材
●離心管 ● 吸頭
試劑
● PBS(pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液phosphate buffer saline/Dμlbecco’s PBS：
約含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl)或者HBSS(Hank"s Balanced Salt Solution； With：Calcium Magnesium Glucose； Without：Phenol Red。Components：CaCl2(anhydrous)140mg/L(1.261mM)、MgCl2-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、Glucose 1000mg/L(5.556mM))

使用方法：

使用注意事項：
● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
●試劑A 為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離心至管底部再打開螺旋蓋。
●試劑A 為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失，在試劑盒中時是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。
● 由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。
● Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。
●試劑A母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
●染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

使用方法：
以下實驗步驟僅供參考，以實際的樣本和文獻(xiàn)參考步驟進行調(diào)整。可以染色懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、制備的細(xì)胞爬片、涂片等原位染色。

1．染色工作液的配制：
根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制染色工作液。
取1ml試劑C加9ml無菌去離子水稀釋，混勻即成1×染色緩沖液。每10ml 1×染色緩沖液中加入10μl染色液A和3-10μl染色液B，充分混勻，即成染色工作液。
【注】：
● 由于不同細(xì)胞系的zuì佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和EthD-I的zuì適濃度。梯度篩選的原則為使用zuì低的探針濃度得到zuì好的熒光結(jié)果。
● 一般細(xì)胞按以上稀釋比例1000倍稀釋即可，個別細(xì)胞可能需要提高濃度至500倍稀釋或者延長染色時間。
● Calcein-AM溶液和EthD-I溶液可以混合在一起染色，也可以分開進行染色，加入的先后順序沒有影響。
2．收集樣本細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量在1×106個以內(nèi)。
3．用PBS洗滌細(xì)胞兩次。
【注】：
● 由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，導(dǎo)致Calcein-AM遇水會分解，會導(dǎo)致空白上升，所以需要用PBS 洗滌數(shù)次直到完全洗凈。
4．用200μl染色工作液將細(xì)胞重懸。
5．4℃避光孵育15-30分鐘。
6．用PBS 洗滌細(xì)胞。
7．用適量PBS重懸細(xì)胞。
8．用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。染料-DNA復(fù)合物的zuì大激發(fā)490±10nm，zuì大發(fā)射波長分別為515nm和617nm。
【注】：
●在熒光顯微鏡下觀察時，如果背景高，可以用培養(yǎng)基再次清洗掉細(xì)胞外的染料后再觀察。

結(jié)果分析：
熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長激發(fā)，活細(xì)胞為黃綠色，死細(xì)胞為紅色。
用528nm波長激發(fā)，能夠看到紅色的死細(xì)胞。

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