我公司的外泌體快速提取試劑盒系列產(chǎn)品，可以通過(guò)簡(jiǎn)單離心快速高效獲得高純度外泌體顆粒。本試劑盒提取的外泌體完好無(wú)缺，能用于各種功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。...

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)

產(chǎn)品編號(hào)：HR8226

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

2-8℃保存，離心管室溫保存。有效期1年。

【注】：

● 離心管中的過(guò)濾膜一旦潤(rùn)濕后應(yīng)避免變干。如果在預(yù)清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

總外泌體（Exosomes）提取試劑盒（乳汁/唾液用）適用于從各種乳汁/唾液樣品中提取總外泌體。不需要超速離心，僅需通過(guò)簡(jiǎn)單的常規(guī)離心即可從樣本中獲取大量結(jié)構(gòu)完整的外泌體，具有快速簡(jiǎn)單，提取效率高的特點(diǎn)，可節(jié)省更多的實(shí)驗(yàn)時(shí)間和樣本。提取的外泌體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠糜诤罄m(xù)的多種實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用范圍廣泛。

外泌體是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體 )的膜性小囊泡，直徑約為30-150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各種體液中，研究發(fā)現(xiàn)，Exosome內(nèi)含有與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA，并且exosome能夠通過(guò)生物屏障，在細(xì)胞間傳遞功能性核酸分子，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能。

外泌體囊泡已經(jīng)成為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，參與原核生物和高等真核生物細(xì)胞之間的生物信號(hào)傳遞，以調(diào)節(jié)不同范圍的生物過(guò)程。外泌體囊泡的病理生理作用開(kāi)始在包括癌癥、感染性疾病和神經(jīng)變性疾病在內(nèi)的疾病中得到充分認(rèn)識(shí)，顯現(xiàn)了外泌體作為疾病的早期診斷、治療干預(yù)的潛在新靶點(diǎn)的巨大應(yīng)用前景。此外，未修飾和工程化的外泌體囊泡可能在大分子藥物遞送中具有應(yīng)用價(jià)值。

傳統(tǒng)的乳汁/唾液中分離和提取exosome的主要方法是超速離心法，這種方法缺點(diǎn)是耗時(shí)耗力，往往需要30-70個(gè)小時(shí)，每次最多只能處理6個(gè)樣品，需要大量的起始材料，而且產(chǎn)量不高。

我公司的外泌體快速提取試劑盒系列產(chǎn)品，可以通過(guò)簡(jiǎn)單離心快速高效獲得高純度外泌體顆粒。本試劑盒提取的外泌體完好無(wú)缺，能用于各種功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒按每個(gè)樣本處理2mL乳汁/唾液計(jì)，每個(gè)50T試劑盒大約可以用于提取100mL乳汁/唾液。如果需要處理大量的乳汁/唾液，將提取液按說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)操作的體積等比例調(diào)整即可。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便,無(wú)需超速離心,省時(shí)省力；

● 純度高,富集量大,應(yīng)用范圍廣；

● 獲取的Exosome結(jié)構(gòu)和功能完整；

● 穩(wěn)定性好,便于運(yùn)輸,便于保存。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

●離心機(jī) ●移液器 ●離心管 ●吸頭

使用注意事項(xiàng)：

● 以下以2mL乳汁/唾液為例，實(shí)際操作時(shí)按血清樣本和提取液用量體積比等比例調(diào)整使用即可。

● 不同乳汁/唾液樣本外泌體數(shù)量差異極大，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇乳汁/唾液樣本的量，根據(jù)下游應(yīng)用和參考文獻(xiàn)確定。條件允許情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 常規(guī)的乳汁/唾液樣本最佳上樣量為3-5mL及以上，條件允許的情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 已經(jīng)分離好的外泌體樣本如果需要進(jìn)行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時(shí)間不超過(guò)兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會(huì)影響電鏡觀察效果。

使用方法：

外泌體提取：

1. 收集2mL待提取的乳汁/唾液樣品，置2-8℃保存。

【注】：

● 凍存樣品解凍后置2-8℃保存。

● 最好使用新鮮樣本，冷凍樣品外泌體回收率會(huì)降低。

2. 將樣品在4℃條件下，3000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。

3. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

4. 將樣品在4℃條件下，10000×g離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。

5. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

6. 在2mL乳汁/唾液樣品中加入2mL提取液A，蓋緊離心管蓋。

7. 輕輕上下顛倒混勻1分鐘左右，使液體充分混勻。制備成4mL待提取外泌體懸液（I）。然后進(jìn)行下列外泌體純化步驟操作。

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)清洗外泌體純化離心管D(大)：

1. 用緩沖液或純水進(jìn)行預(yù)清洗。

2. 離心管中的過(guò)濾膜一旦潤(rùn)濕后應(yīng)避免變干。如果在預(yù)清洗后不是立即使用,則讓液體保留在濾膜上,直到使用。

【注】：

● 可以在外泌體提取步驟中需要使用前再清洗。

● 重復(fù)使用時(shí)要仔細(xì)檢查管壁上有沒(méi)有裂紋。

外泌體純化：

1. 將外泌體純化離心管D(大)內(nèi)管插入所提供的一個(gè)配套離心管中。

2. 向內(nèi)管中加入過(guò)4mL的待提取外泌體懸液（I）樣本，并蓋上蓋子。

【注】：

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時(shí),必須防止碰到濾膜,以免戳破濾膜。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時(shí),可以用藍(lán)吸頭(1mL)；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時(shí),必須用黃吸頭(200μL)。

3. 將蓋好蓋子的外泌體純化離心管放入離心轉(zhuǎn)子中,用一個(gè)類似的離心管平衡。

【注】：

● 最好使用非固定角度的轉(zhuǎn)子。

● 使用固定角度轉(zhuǎn)子時(shí),將白色膜片面朝上放置。

● 如果使用固定角轉(zhuǎn)子，最好適當(dāng)減少待提取外泌體懸液體積，可以加至3.5mL。

4. 以4000×g 離心約10-15 分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過(guò)度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請(qǐng)監(jiān)控離心過(guò)程，以免樣本過(guò)度濃縮。過(guò)度濃縮會(huì)導(dǎo)致沉淀，這也可能帶來(lái)樣本損失。第一次做新樣品時(shí)，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過(guò)液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測(cè)試完成。

避免吸頭戳破濾膜導(dǎo)致外泌體損失。

● 影響流速的因素包括樣本濃度、相對(duì)離心力、離心轉(zhuǎn)子的角度以及溫度。常見(jiàn)樣本的典型離心時(shí)間大約是10至20分鐘。大部分樣本在離心開(kāi)始后的前5至10分鐘發(fā)生過(guò)濾純化，但在離心10至20分鐘后才能達(dá)到最低的純化液體積（20μL）。

● 可以將濃縮的外泌體用PBS或HEPES等緩沖液（根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)需要選擇）稀釋，再次離心至大約剩余50μL-100μL，這樣的外泌體純度將再次提高，殘余的外源蛋白質(zhì)和核酸更少。

5. 在50-100μL殘余液體中加入2mL外泌體提取液B。

6. 以4000×g離心約10-15分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過(guò)度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請(qǐng)監(jiān)控離心過(guò)程，以免樣本過(guò)度濃縮。過(guò)度濃縮會(huì)導(dǎo)致沉淀，這也可能帶來(lái)樣本損失。第一次做新樣品時(shí)，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過(guò)液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測(cè)試完成。

避免吸頭戳破濾膜導(dǎo)致外泌體損失。

7. 離心結(jié)束后將整個(gè)離心管從離心機(jī)中取出，取出內(nèi)管。

【注】：

● 外泌體可能會(huì)有少量的吸附損失，吸附損失取決于外泌體濃度、與過(guò)濾純化內(nèi)管表面接觸的溫度和時(shí)間。為了最大限度降低損失，離心后請(qǐng)立即回收過(guò)濾后的外泌體樣本。

8. 為了回收純化后的外泌體，用200μL移液器插入純化管的底部，吸出純化后的50-100μL 純化外泌體懸液（II）。

【注】：

● 要達(dá)到理想的回收效果，請(qǐng)盡快吸出純化外泌體懸液。

● 從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時(shí)，必須用黃吸頭。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時(shí)，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 注意確保外泌體懸液完全吸出。

9. 套上外泌體純化離心管E（小）的液體收集管，將純化外泌體懸液（II）吸入外泌體純化離心管E（小）的離心管（內(nèi)管）中，在4℃，11000-13000×g條件下離心10-15分鐘。

【注】：

● 外泌體純化離心管E（小）重復(fù)利用，一般一個(gè)離心管可以用5-10次。

● 外泌體純化離心管E（小）內(nèi)管對(duì)外泌體沒(méi)有吸附，離心后可以直接重復(fù)使用。

● 如果需要清洗離心管，可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000×g離心10 分鐘即可。

10. 吸取外泌體純化離心管E（小）的收集管中的液體，即得到外泌體樣品純品。

【注】：

● 可以根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)需要，用相應(yīng)的緩沖液稀釋保存外泌體。

● 也可以用試劑盒中配的外泌體保存液稀釋保存外泌體。

● 也可直接用于外泌體蛋白提取。

● 將外泌體樣本-80℃保存或直接用于下游應(yīng)用。

● 外泌體短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上長(zhǎng)期不用時(shí)置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm或0.35μm濾器過(guò)濾除菌。

11. 用純水或緩沖液洗滌兩種大小的內(nèi)管和收集管，繼續(xù)純化下一個(gè)樣品。

【注】：

● 洗滌內(nèi)管時(shí)，加入400μL PBS緩沖液或其它緩沖液，用吸頭反復(fù)吹打，吸掉緩沖液即可。

● 用PBS洗滌3-4次。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時(shí)，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 每個(gè)離心管內(nèi)管建議重復(fù)使用5次，不要超過(guò)10次。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時(shí)，可以用藍(lán)吸頭；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時(shí)，必須用黃吸頭。

● 如果使用過(guò)的離心管需要長(zhǎng)期保存，可以按下列方法清洗和保存離心管內(nèi)管。

外泌體純化離心管(大)清洗和保存：

1. 使用后用水沖洗干凈；

2. 內(nèi)管加入超純水4mL，4000×g離心5分鐘；

3. 吸凈內(nèi)管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g離心20分鐘；

4. 用0.1M NaOH浸泡24小時(shí)；

5. 用水沖洗干凈；

6. 用無(wú)菌水浸泡2-8℃保存。

7. 外管用自來(lái)水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

【注】：

● 1個(gè)月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長(zhǎng)時(shí)間的話加0.02%的疊氮鈉。

● 再次用前，用純水充分沖洗干凈，然后根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)需要，用相應(yīng)的緩沖液平衡。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測(cè)（形態(tài)）、粒徑檢測(cè)（大小）、外泌體標(biāo)志蛋白Western blot檢測(cè)等方法鑒定提取的外泌體。

● 外泌體WB標(biāo)志蛋白用什么？

在進(jìn)行WB 檢測(cè)時(shí)，通常檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白為CD63、CD9、CD81、TSG101 、ALIX、HSP70等。

● 進(jìn)行外泌體WB 鑒定時(shí)有什么內(nèi)參蛋白可供選擇？

沒(méi)有，該檢測(cè)屬于定性檢測(cè)。

● 蛋白濃度低？

很多細(xì)胞外泌體量不夠下游應(yīng)用，在條件允許的情況請(qǐng)盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

處理部分樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。請(qǐng)選擇高質(zhì)量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

● 抽提得到的RNA濃度低？

很多細(xì)胞外泌體量不夠下游應(yīng)用，在條件允許的情況請(qǐng)盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

● 外泌體純化管內(nèi)管膜會(huì)因?yàn)殡x心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而變干么？

不會(huì)，因?yàn)閮?nèi)管有死體積，總會(huì)有溶液殘留在內(nèi)管中。死體積大約10-20μL。

● 可以重復(fù)使用過(guò)濾管么？

可以重復(fù)使用。如果使用、清洗、保存得當(dāng)，可以反復(fù)使用多次。但是超過(guò)8次重復(fù)使用后過(guò)濾膜有破損風(fēng)險(xiǎn)，注意使用過(guò)程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過(guò)大。

● 外泌體在純化時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？

如果過(guò)濾過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起沉淀。如果樣品的外泌體濃度很高，建議降低最終的外泌體濃度，保留更多的液體。

對(duì)于因過(guò)濾速度敏感而導(dǎo)致的沉淀，建議的改進(jìn)方法是：

1）離心力降低30%-50%

2）在過(guò)濾過(guò)程中取出過(guò)濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次。

● 有時(shí)候用外泌體純化離心管連水都離不下來(lái)，可能是什么原因？

如果出現(xiàn)這種情況，可能時(shí)過(guò)濾膜的孔被堵住。請(qǐng)先用0.1M NaOH清洗再離心。

最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。

● 說(shuō)明書(shū)中推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到外泌體的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進(jìn)行離心？

可以，但是低溫可能會(huì)增加外泌體樣品的粘性，導(dǎo)致流速減慢，建議可將離心時(shí)間延長(zhǎng)。