本產品是采用N01/PI雙染法染色活細菌和死細菌。本試劑盒中的N01活細菌核酸染色探針為綠色熒光標記的活細菌探針，具有500/525nm的最大激發/發射波長。...

活細菌/死細菌雙染試劑盒

產品編號：HR8597

試劑盒組成：

保存條件：

染色液A -20℃避光保存；染色液B 2-8℃避光保存，避免反復凍融。有效期1年。

【注】：

● 染料長期不用可以-20℃保存。避免反復凍融。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

活細菌/死細菌雙染試劑盒產品簡介：

本產品是采用N01/PI雙染法染色活細菌和死細菌。本試劑盒中的N01活細菌核酸染色探針為綠色熒光標記的活細菌探針，具有500/525nm的最大激發/發射波長。

當膜通透性的綠色熒光探針N01進入細菌后，選擇性的跟DNA結合。染色探針N01在進入細胞膜之前熒光較弱，當與DNA結合后其熒光強度大大增強，被激發后可以發出綠色的熒光，具有很高的淬滅常數和激發態壽命。

紅色核染色染PI不能穿過活細菌的細胞膜，它僅穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光(激發：488，545nm，發射：617 nm)，因此PI僅對死細胞染色。

由于N01-DNA和PI-DNA都可被488nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。根據以上特點，N01和PI可以被結合用來作為活細菌和死細菌的雙重染色。

本試劑盒是利用活死細菌的膜通透性改變進行的檢測，適用于熒光顯微鏡和流式細胞儀。本測定原理適用于大多數細菌類型，包括各種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌。細菌活力的常見標準是細菌在合適的營養培養基中繁殖的能力生長測定，使用本試劑盒產生的結果與液體或固體培養基中的生長檢測相關性良好。但是需要注意，不同于動物細胞，在一定的條件下，具有損傷膜的細菌可能能夠恢復和繁殖，這種細菌可以在本試劑盒的測定中被檢測為“死亡”。相反，一些膜完整的細菌可能無法在營養培養基中繁殖，然而這些細菌可能被記為在這個測定中被檢測為“活著”。如果在該測定法和細菌之間觀察到相當大的差異，應該考慮這些可能性。

以每個樣本100μL染色液計，本試劑盒小包裝可以染色500個樣本。

熒光探針N01除了最簡單的細菌核熒光標記外，還可以用于熒光成像，微孔板分析和流式細胞術。在合適的濾光器下，這種DNA結合染料與其他顏色的熒光染料一起可用于活細菌的多種顏色分析。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/熒光酶標儀/熒光分光光度計/激光共聚焦/流式細胞儀等

● 離心機 ● 移液器 ● 0.85% NaCl溶液

使用注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。融解后離心至管底部再打開螺旋蓋。

● 試劑A為了便于觀察防止誤操作導致損失，在試劑盒中時是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。

● 建議收到產品后，根據單次使用量，對N01母液進行小量分裝，每次使用一管，試劑-20℃避光凍存，一年穩定。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 所有染色液操作在塑料容器進行，不要在玻璃容器染色。

● 以下為進行活死細菌染色觀察的參考步驟，可以根據文獻的方法進行調整。如果有必要，也可以設定對照活細菌和死細菌，進行定量檢測。可以可以根據需要自己設定對照和檢測方法。

● 標記的條件因細菌種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細菌類型、細菌的膜通透性等進行優化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 流式檢測時建議添加直徑6.0μm微球標準品。

● 細菌類型會明顯影響紅色熒光的量。

關于細菌死/活的定義標準：

● 需要注意任何單一指標判斷細菌死活的局限性。就單個細菌樣本的生理狀態而言，并不容易定義生存能力或形態參數，因此進行單個指標的生存力測定可能會在實驗中引入特定的偏見。

● 本產品的這種LIVE/DEAD細菌膜通透性染色測定與在合適的液體或固體營養培養基中進行生長分析的其他細菌生存力的標準一般需要結合分析。在某些情況下，細菌膜受損可能會恢復和繁殖，即使此類細菌在本產品分析中可能被評為“死亡”。相反，某些具有完整膜的細菌可能無法在營養培養基中繁殖，但在本產品分析中被評為“活”。

● 幾種不同生存能力衡量指標，例如膜滲透性，酶活性和氧化還原電位需綜合分析評判，才可能提供更多徹底評估細菌生存力并清除固有任何單一生存力測定法的局限性。

活細菌/死細菌雙染試劑盒關于染色條件的優化：

● 不同的細菌類型會明顯影響熒光的量。

● 建議的染色條件染色以下細菌類型顯示出良好的相關性，其它細菌類型請在以下范圍或超過以下濃度范圍內測試最佳染色條件：Bacillus cereus,B. subtilis,Clostridium perfringens,Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,Micrococcus luteus,Mycobacterium phlei, Pseudomonas aeruginosa,P.syringae,Salmonella oranienburg,Serratia marcescens,Shigella sonnei,Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes,Agrobacterium tumefaciens,Edwardsiella ictaluri,Eurioplasma eurilytica,Lactobacillus sp.,Mycoplasma hominus,Propionibacterium sp.,Proteus mirabilis and Zymomonas sp.。

● 標記條件因細菌種類而異，根據不同樣本實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細菌類型、細菌的膜通透性等進行優化，確定最佳條件。

使用方法：

根據樣品數按下列比例配制染色工作液。

用37℃培養箱預熱0.85% NaCl溶液將N01熒光染料進行500倍稀釋，將PI進行100-500倍稀釋，配制成染色工作液。

例如：

每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20μL染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。

每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100μL染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。。

【注】：

● 由于不同細菌的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定N01和PI的最適濃度。梯度篩選原則為使用最低探針濃度得到最好的熒光結果。為了降低探針加載過度可能引起的假陽性，建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 開始實驗前，使用0.85% NaCl溶液稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據不同細菌的預實驗結果確定的最佳工作濃度，建議至少在超過10倍范圍的濃度下進行測試。

● 一般N01染色終濃度為試劑盒中染料母液的500倍稀釋適合大多數細菌樣本。極個別細菌樣本可能需要提高染色濃度至200倍稀釋。

● PI的使用終濃度為染料母液的100-1000倍稀釋，150-300倍適合大多數細菌樣本。

● N01和PI可以混合在一起染色，也可以分開進行染色。初次實驗時，最好分開染色。經過多次實驗優化后，能確定兩種染料的最佳濃度后可以混合在一起染色。

● 兩種染料的比例根據情況進行調整，如果綠色過于突出，可以降低N01的濃度或者稍微提高PI的濃度；如果紅色過于突出，則增加N01的用量或降低PI的用量。

● 注意PI的濃度在染上色的前提下盡可能低，否則可能有細胞毒性，使原本的活細胞染上色。

● 確定了染色終濃度以后，可以將染色液配制成100×的工作液，使用時按每100 μL細菌懸液中加入1μL染色液，充分混勻后染色。

細菌染色：

1. 收集樣本細菌，用0.85% NaCl溶液洗滌細胞3次。

【注】：

● 必須充分洗滌以去除培養基，殘余的培養基會影響染色效果。

● 不要用PBS等磷酸鹽緩沖液洗滌，會影響染色效果。

● 一般10000×g下離心10-15分鐘沉淀細胞。

2. 用100μL-200μL染色工作液將細菌重懸。

【注】：

● 也可先用0.85% NaCl溶液制備細胞懸液，然后按比例加入100×的染色工作液。

● 初次實驗時兩種染料分別染色。

3. 在室溫避光孵育15分鐘。

4. 用0.85% NaCl溶液洗滌細菌一次。

5. 用適量0.85% NaCl溶液重懸細菌。

6. 將5μL菌液滴加到載玻片，蓋上蓋玻片，油鏡觀察。

7. 用熒光顯微鏡觀察。激發波長為488nm，最大發射波長為525nm 和617nm。

【注】：

● 在熒光顯微鏡下觀察時，如果背景高，可以再次清洗掉細胞外的染料后再觀察。

結果分析 ：

可以在Ex/Em = 488/525nm（FITC濾光器組）和540/620nm（TRITC濾光器組）下熒光測量染色細胞，分別用于活細菌和死細菌。

熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長激發，活細菌為黃綠色，死細菌為紅色。

用545nm波長激發，僅能夠看到紅色的死細菌。