本試劑盒按每個樣本處理4 ml細胞培養上清計，每個50T試劑盒大約可以用于提取200ml細胞培養上清。如果需要處理大量的細胞培養上清，將提取液按細胞培養上清體積的1：4加入細胞培養上清即可。...

囊泡提取試劑盒(細胞培養上清,超純)

產品編號：HR9100

產品組成：

儲存條件：

提取液、保存液2-8℃保存，離心管RT保存；有效期1年。

【注】：

● 離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。

產品說明：

細胞外囊泡（Extracellular Vesicles）提取試劑盒（細胞培養上清用，超純）適用于從各種原代或傳代培養細胞培養上清樣品中提取高純度細胞外囊泡。不需要超速離心，僅需通過簡單的常規離心即可從樣本中獲取大量結構完整的囊泡，具有快速簡單，提取效率高的特點，可節省更多的實驗時間和樣本。提取的囊泡可根據實驗目的用于后續的多種實驗，應用范圍廣泛。

傳統的體外培養的細胞中分離和提取微囊泡的主要方法是超速離心法，這種方法缺點是耗時耗力，往往需要30-70個小時，每次最多只能處理6個樣品，需要大量的起始材料，而且產量不高。

我公司自主開發的囊泡快速提取試劑盒系列產品，可以通過簡單離心快速高效獲得高純度囊泡顆粒。本試劑盒提取的囊泡完好無缺，能用于各種功能研究、蛋白分析及RNA分析、電鏡分析、NTA粒徑分析等下游實驗應用。

本試劑盒按每個樣本處理4 ml細胞培養上清計，每個50T試劑盒大約可以用于提取200ml細胞培養上清。如果需要處理大量的細胞培養上清，將提取液按細胞培養上清體積的1：4加入細胞培養上清即可。

產品特點：

● 使用方便，無需超速離心，省時省力；

● 純度高，富集量大，應用范圍廣；

● 獲取的Exosome結構和功能完整；

● 穩定性好，便于運輸，便于保存。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機 ● 移液器 ● PBS或者HBSS ● 純水

囊泡提取試劑盒(細胞培養上清,超純)注意事項：

● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 以下以4ml培養基為例，實際操作時按培養基和提取液A用量體積比4：1使用即可。

● 不同細胞分泌的囊泡數量差異極大，請根據實際情況選擇培養基樣品的量，根據下游應用和參考文獻確定。條件允許的情況下采用盡可能多的細胞培養上清。

● 一般巨噬細胞、淋巴細胞、造血細胞、胰腺癌細胞等分泌囊泡較多，其它細胞樣本建議每個樣培養基上清用量不少于8ml。常規的細胞樣本最佳培養上清上樣量為15-20ml及以上，條件允許的情況下采用盡可能多的細胞培養上清。

● 條件允許的情況下可以將細胞培養上清濃縮后再提取囊泡。

● 在收獲細胞時，應確定死亡細胞不超過5%。細胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡，它們在囊泡的提取過程中會污染活細胞產生的囊泡。

● 已經分離好的囊泡樣本如果需要進行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時間不超過兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會影響電鏡觀察效果。

使用方法：

囊泡提取：

1、收集4ml待提取的培養基樣品，置2-8℃保存。

【注】：

● 凍存樣品置水浴鍋解凍后置2-8℃保存。

2、將樣品在4℃條件下，3000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。

3、小心將上清移入另一干凈離心管中。

4、將樣品在4℃條件下，10000×g離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。

5、小心將上清移入另一干凈離心管中。

6、在4ml上清中加入1ml提取液A，蓋緊離心管蓋，上下顛倒混勻1分鐘左右，使液體充分混勻。

【注】：

● 試劑A使用前請充分混勻。

7、置2-8℃冰箱靜置過夜。

【注】：

● 靜置保存時間不少于10小時。

8、在4℃條件下，10000×g離心60分鐘。

9、小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

● 盡可能吸干上清。

● 吸取時小心，防止吸掉沉淀。

10、取500μL囊泡保存液將沉淀重懸，用移液器輕輕吹打混勻，得到囊泡沉淀重懸液，進行下列囊泡純化步驟操作。

清洗囊泡純化離心管：

1、用緩沖液或純水進行預清洗。

2、離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。

【注】：

● 可以在囊泡提取步驟中需要使用前再清洗。

● 重復使用時要仔細檢查管壁上有沒有裂紋。

囊泡提取試劑盒(細胞培養上清,超純)囊泡純化：

1、將囊泡純化離心管內管插入所提供的一個微量離心管中。

2、向內管中加入過500μL的囊泡沉淀重懸液樣本，并蓋上蓋子。

【注】：

● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 加囊泡懸液或Buffer到內管時，可以用藍吸頭；但從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。

3、將蓋好蓋子的囊泡純化離心管放入離心轉子中，讓蓋子的連接帶朝著轉子的中央；用一個類似的離心管平衡。

4、以5000-8000×g離心約10-15分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。

● 如果囊泡樣本的起始濃度很高，請監控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過液吸入1.5ml帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到囊泡的樣品分析測試完成。避免吸頭戳破濾膜導致囊泡損失。

● 影響流速的因素包括樣本濃度、相對離心力、離心轉子的角度以及溫度。500μL樣本的典型離心時間大約是10至20分鐘。大部分樣本在離心開始后的前5至10分鐘發生過濾純化，但在離心10至30分鐘后才能達到最低的純化液體積（20μL）。

● 可以將濃縮的囊泡用PBS或HEPES等緩沖液（根據下游實驗需要選擇）稀釋，再次離心至大約剩余50μL-100μL，這樣的囊泡純度將再次提高，殘余的外源蛋白質和核酸更少。

5、離心結束后將整個離心管從離心機中取出，取出內管。

【注】：

● 囊泡可能會有少量的吸附損失，吸附損失取決于囊泡濃度、與過濾純化內管表面接觸的溫度和時間。為了最大限度降低損失，離心后請立即回收過濾后的囊泡樣本。

6、為了回收純化后的囊泡，將內管倒過來插在另一個干凈的微量離心管中。放在離心機中，讓打開的蓋子朝著轉子的中央；用一個類似的離心管進行平衡。

7、以1000×g離心2分鐘，使純化后的囊泡樣本從純化內管轉移到收集管中。

【注】：

● 要達到理想的回收效果，請盡早進行倒置離心。

● 也可不倒置離心，直接用移液器直接吸出內管中的樣品。

● 從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。

● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

8、吸取收集管中的液體，即得到囊泡樣品純品。

【注】：

● 可以根據下游實驗需要，用相應的緩沖液稀釋保存囊泡。

● 也可直接用于蛋白提取。

● 將囊泡樣本-80℃保存或直接用于下游應用。

● 囊泡短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上長期不用時置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm或0.35μm濾器過濾除菌。

9、用純水或緩沖液洗滌內管和收集管，繼續純化下一個樣品。

【注】：

● 洗滌內管時，加入400μL PBS緩沖液或其它緩沖液，用吸頭反復吹打，吸掉緩沖液即可。

● 用PBS洗滌3-4次。

● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 每個離心管內管建議重復使用5次，不要超過10次。

● 加囊泡懸液或Buffer到內管時，可以用藍吸頭；但從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。

● 如果使用過的離心管需要長期保存，可以按下列方法清洗和保存離心管內管。

囊泡純化離心管清洗和保存：

1、使用后用水沖洗干凈；

2、內管加入超純水500μL，5000×g 離心5分鐘；

3、吸凈內管中的水，加入500μL 0.1M NaOH，5000×g離心20分鐘；

4、用0.1M NaOH浸泡24小時；

5、用水沖洗干凈；

6、用無菌水浸泡2-8℃保存。

7、外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

【注】：

● 1個月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長時間的話加0.02%的疊氮鈉。

● 再次使用前，用純水充分沖洗干凈，然后根據下游實驗需要，用相應的緩沖液平衡。

常見問題分析：

● 培養細胞時，如何去除血清來源的囊泡？

多數情況下，細胞在體外培時養需要血清，而血清中一般都含有囊泡，為避免血清對細胞囊泡的污染，可采用以下方法：（1）將細胞培養用的血清通過100000×g超速離心10小時以上以去除血清囊泡；（2）選擇無血清培養基進行細胞培養。

● 無囊泡血清培養基（或者無血清培養基）在什么時候使用？

細胞在正常含血清的培養基中培養一定的時間后，細胞融合度約為60%-70%時，移去原有含血清的培養基，換成新鮮的無囊泡血清培養基（或者無血清培養基），繼續培養24-48h，細胞融合度達到80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取細胞外囊泡。

● 蛋白濃度低？

很多細胞外囊泡量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養上清的上樣量。

處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。請選擇高質量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

● 囊泡純化管內管膜會因為離心時間過長而變干么？

不會，因為內管有死體積，總會有溶液殘留在內管中。死體積大約10-20μL。

● 可以重復使用過濾管么？

可以重復使用。如果使用、清洗、保存得當，可以反復使用多次。但是超過8次重復使用后過濾膜有破損風險，注意使用過程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過大。

● 囊泡在純化時出現了沉淀，如何改進？

如果過濾過快或者過度濃縮都有可能引起沉淀。如果樣品的囊泡濃度很高，建議降低最終的囊泡濃度，保留更多的液體。

對于因過濾速度敏感而導致的沉淀，建議的改進方法是：

1）離心力降低30%-50%

2）在過濾過程中取出過濾管，用槍頭反復吹吸幾次。

● 有時候用囊泡純化離心管連水都離不下來，可能是什么原因？

如果出現這種情況，可能時過濾膜的孔被堵住。請先用0.1M NaOH清洗再離心。

最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態，避免重新干燥。

● 說明書中推薦在室溫下進行離心，考慮到囊泡的穩定性，是否可以在4℃進行離心？

可以，但是低溫可能會增加囊泡樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長。