Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒可以方便快捷的檢測凋亡細胞，可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或其它有相應波長的熒光檢測設備進行檢測。一般最常用的凋亡試劑盒是采用Annexin V-FITC與PI聯用。如果細胞本身帶有綠色熒光，可以選擇其它顏色。...

Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒

產品編號：HR0399

產品組成：

儲存條件：

2-8℃避光保存，長期保存于-20℃避光，避免反復凍融，多次凍融會導致失效。需要長期保存時可以根據使用情況進行小量分裝后-20℃保存。有效期1年。

產品簡介：

用標記了FITC 的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

早期凋亡細胞可以與Annexin V-FITC結合，細胞壞死的過程中也會發生細胞膜損傷，壞死的細胞也會結合Annexin V-FITC。Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜與細胞核結合呈現紅色。將Annexin V-FITC與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和凋亡晚期的細胞/壞死細胞區分開來。

壞死細胞可以同時與Annexin V-FITC和PI結合顯色，而PI則被排除在活細胞（FITC陰性）和早期凋亡細胞（FITC陽性）之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的最后階段會像細胞壞死一樣發生整個細胞的解體，從而使凋亡晚期的細胞也同時被FITC和PI結合染色呈現雙陽性。

Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒可以方便快捷的檢測凋亡細胞，可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或其它有相應波長的熒光檢測設備進行檢測。

一般最常用的凋亡試劑盒是采用Annexin V-FITC與PI聯用。如果細胞本身帶有綠色熒光，可以選擇其它顏色。

Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒特點：

● 方便：可用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測；

● 快速：1小時內即可完成實驗；

● 準確：能準確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并計數各群細胞的比例。

檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 激光共聚焦 ● 熒光顯微鏡 ● 熒光酶標儀

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器

● 流式細胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 移液器 ● 離心機 

● PBS或HBSS ● 鋁箔

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導致試劑量不夠用。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。離心力在不損失細胞的前提下盡可能小，重懸細胞是動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。

● Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標記后將細胞保持在避光環境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。

● 由于細胞凋亡是一個快速和動態的過程，因此最好在染色后立即進行分析。

● 使用Annexin V-FITC試劑盒檢測凋亡需要針對活細胞。不要固定細胞，固定操作會對結果產生干擾。

● 因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。

● 如果細胞樣品中含有血小板，如血液樣品，請使用含有EDTA的緩沖劑并200g離心洗去血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合。從而影響實驗結果。

● 流式細胞儀檢測時，細胞數量應不低于1×10⁵。

● 如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意用PBS 洗凈去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，最終導致染色失敗。

● 貼壁細胞誘導凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。中晚期凋亡細胞失去貼壁能力而漂浮于培養基，此部分細胞對結果有顯著影響，不可隨意丟棄，需離心后收集與貼壁細胞一起檢測，才能全面的反映出細胞凋亡的整體情況；

● 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞，胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC 的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中應不用EDTA，EDTA影響Annexin V與PS的結合。

● 成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS 的密度、發生凋亡時PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時間以及實驗過程中機械損傷的程度等，把這些影響因素進行優化對實驗成功與否至關重要。務必根據每次實驗樣本類型和操作流程對這些步驟進行優化。

● 在進行流式細胞儀檢測之前，事先進行顯微鏡觀察有好處。

● 有極少數細胞株其細胞膜上PS的密度很低，難以染色，此時不適合用Annexin V方法檢測凋亡。

● Annexin V染色常見到即使未凋亡的細胞（Annexin V-/PI-細胞），經過染色后在流式圖上的位置也會右移。通常通過多次洗滌洗去多余染料來將活細胞群（Annexin V-/PI-細胞群）調整到我們通常認為的“陰性細胞”位置的方法不可行。

● 需要注意，隨著時間的推移，PI 染料也是可以進入活細胞的，因此PI 染料應該在分析前加入，短時間內（盡可能小于10分鐘）上機。PI染色方案應該標準化。

● Annexin V試劑如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

● 貼壁細胞原位檢測時，注意部分凋亡細胞會由于不貼壁漂浮起來而檢測不到。

● 在開始實驗之前，請注意磷脂酰絲氨酸翻轉是細胞凋亡的早期事件。這種現象可能會在DNA斷裂之前幾個小時發生，因此，當使用這種方法分析細胞時，應研究藥物處理細胞后的早期時間點。

● 不同細胞類型的磷脂酰絲氨酸含量不同，細胞凋亡開始后細胞表面的暴露量也不同。以下方案是是常用的實驗指南，但是在各種實際模型樣本中，可能有必要調整Annexin V的濃度。通常，Annexin V的1：100稀釋是合適的，但是，有些樣本可能需要1:200至1：400的稀釋度。

● 在與Annexin V-FITC孵育之前，不能固定細胞。

Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒使用方法：

樣品染色：

1、離心收集懸浮細胞。離心機約300×g力，2-8℃，離心時間5分鐘，棄培養基。

【注】：

● 不同細胞完全沉降的離心力有差異，離心轉速根據平時該細胞實驗時的轉速即可。離心力過大會損傷細胞膜。

● 此處以懸浮細胞為例，貼壁細胞消化后收集。也可以原位染色后觀察拍照。

● 貼壁細胞用不含EDTA 的胰酶消化后離心，收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防損傷細胞膜，引起假陽性。

● 貼壁細胞必須將細胞消化好，不可有粘附或者成團，可在消化以后在鏡下觀察（必須得進行的操作）。不可以將為消化好的細胞用移液器強行吹打下來，可能損傷細胞膜。不可以用細胞刮刀刮細胞，可能損傷細胞膜。

● 檢測貼壁細胞時，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因為可能存在一些掉下來的凋亡細胞，在胰酶消化后，再將這些上清加回去，一起檢測，結果更加準確。

● 可使用0.25%胰蛋白酶或含0.02%至2% EDTA的PBS或HBSS溶液將貼壁細胞消化下來。用胰蛋白酶消化時要小心，以防止細胞過度損傷。

使用EDTA時，有必要在標記前用1×PBS 或1×結合緩沖液洗滌兩次細胞以除去所有EDTA，以避免螯合膜聯蛋白結合所需的鈣。。

2、用冷PBS洗滌細胞兩次。

【注】：

● 300×g-500×g，2-8℃，離心時間5分鐘收集細胞

3、用400μL 1×Annexin V結合液重新懸浮細胞，濃度大約為1×10⁶ cells/ml。

【注】：

● 重懸操作需要輕柔，不可以用力吹打，但是要充分混勻。

4、在細胞懸浮液中加入5μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育15分鐘。

【注】：

● 不同細胞類型的磷脂酰絲氨酸含量不同，細胞凋亡開始后細胞表面的PS暴露量也不同。通常，膜聯蛋白V的1：100稀釋是合適絕大數細胞的，其中Annexin V-FITC的量是過剩的。

● 但是，對有些PS極少的細胞，可能有必要調整膜聯蛋白V的濃度，可能需要1:200至1：400的稀釋度。

5、加入5-10μL PI染色液后輕輕混勻于2-8℃避光條件下孵育2-5分鐘。

【注】：

● PI用量可以在染色清晰的前提下盡可能減少。

● 染色時間盡可能短，如果不能及時檢測，可以在檢測前再加PI。

● 需要注意，隨著時間的推移，PI染料也是可以進入活細胞的，因此PI染料應該在分析前加入，短時間內（盡可能小于10分鐘）上機。PI染色方案應該標準化。

6、立即用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

【注】：

● 染色完成后要盡快上機檢測，因為細胞在Annexin V結合緩沖液中存活時間不會太長。時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

● 流式儀器上機檢測之前，盡可能在顯微鏡下觀測一下，看細胞膜有沒有著綠色，細胞核有沒有著紅色，直接可以觀察到早期凋亡和壞死細胞，可以在有根據的情況下去上機檢測。

流式細胞儀分析：

上機檢測前，必須用待測細胞制備三個質控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：

① 空白管，未染色的細胞：不加Annexin V-FITC，不加PI。用于調節電壓。

② 單染管，Annexin V-FITC單染細胞：用明顯凋亡的細胞，僅用Annexin V-FITC染色細胞。用于調節補償。

③ 單染管，PI 單染細胞：僅用PI染色細胞。用于調節補償。

④ 檢測管：待測的處理細胞，加Annexin V-FITC，加PI。用空白管和單染管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。

【注】：

● 具體流式設置按常規方法即可。

● 流式上機檢測之前，盡可能在顯微鏡下觀測一下，看細胞膜有沒有著綠色，細胞核有沒有著紅色，直接可以觀察到早期凋亡和壞死細胞，可以在有根據的情況下去上機檢測。

● 因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此每次檢測均需進行熒光補償的調節。

● 要特別注意在FSC/SSC圈門時，所選細胞范圍會對結果造成較大影響，分析時要把所有分析對象都圈進FSC/SSC的門內，這樣才能反映真實情況。

● 建議點圖的X軸反映Annexin V-FITC熒光，Y軸反映碘化丙啶的熒光。凋亡細胞具有變化的光散射特性，這必須在流式細胞儀中進行補償。未經處理，未標記的細胞應出現在對數點圖的左下象限中。進行實驗時，必須校準流式細胞儀，以避免兩個光電倍增管（PMT）通道之間的光譜重疊。

經處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。激發波長為488nm。

按照常規的流式凋亡檢測的操作即可。

Annexin V-FITC的綠色熒光發射波長530nm，信號可以通過FL1（FITC接收器）

通道檢測；

PI紅色熒光在620nm，通過FL2（Propidium iodide接收器）通道或FL3通道檢測。

熒光顯微鏡/激光共聚焦觀察：

1、滴加30-50μL用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

【注】：

● 對于貼壁細胞，可以象懸浮細胞那樣染色后， 滴一滴細胞懸液于載玻片上，用蓋玻片蓋上細胞，熒光顯微鏡下觀察。

● 也可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。根據蓋玻片大小，置于24孔或12孔細胞培養板內培養，然后誘導細胞凋亡。細胞染色在細胞培養板內進行。先用PBS 沖洗兩次，加入400μL Annexin V結合液于孔中。再加入5μL Annexin V-FITC染色液與10μL Propidium Iodide染色液，混勻。避光室溫反應10分鐘。

● 用激光共聚焦顯微鏡檢測時，貼壁培養細胞應培養在Confocal專用小培養皿或蓋玻片上。

根據實際情況調整染色液的用量，用Annexin V結合液稀釋兩種染料，終濃度在100倍以內即可。

● 懸浮細胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片。。

2、在熒光顯微鏡/激光共聚焦下觀察。

使用熒光顯微鏡上的FITC濾鏡（藍光激發），Annexin V-FITC染色陽性的細胞將在細胞膜表面呈現明亮的蘋果綠色。使用PI濾鏡（綠光激發），Propidium Iodide染色陽性的細胞則會在整個胞質內呈現不同強度的黃-紅色。早期凋亡細胞不會被Propidium Iodide染色或顯示背景熒光，而壞死或晚期凋亡細胞則會顯示出黃-紅色的胞質，紅色的胞核和環繞細胞的綠色胞膜。在晚期凋亡細胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。

【注】：

● 不同儀器的配置不同，以實際為準。

● 在同一個視野中， FITC和PI之間可能存在明顯的信號重疊，從而使得結果的解釋變得困難。正常情況下，會看到強PI的明亮細胞以及染色較淺的PI細胞。降低標記反應中PI的濃度可能會得到更好的結果。

常見問題分析：

● 實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。可能的原因如下：

1、用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調整使用正確的儀器設置。

2、確定實驗中的誘導劑是否能產生凋亡。可通過設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。

3、細胞未啟動凋亡。重新確定誘導后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。

4、細胞數量偏少。增加細胞數量。

5、貼壁細胞消化不當。Annexin V跟PS的結合需要Ca²⁺離子，結合液中含有Ca²⁺，EDTA的消化會影響染色，建議使用無EDTA的胰酶，或者消化后用PBS洗滌干凈。

6、與抗體結合不同，Annexin V與PS的結合不像抗原抗體的結合那樣穩定，也不容易被固定，所以在標記結束后1-2小時內必須要上機檢測。

7、細胞離心用冷PBS洗滌后，應盡量吸干殘余液體，殘余過多的PBS中含有磷酸根，會形成磷酸鈣沉淀，影響Annexin V的染色。

8、Annexin V結合液瓶蓋要蓋緊密封，長時間暴露于空氣后，空氣中的CO₂進入后形成CaCO₃會產生沉淀，從而減少游離的Ca²⁺，導致實驗的結果不佳。

9、污染其他的緩沖液。如吸取PBS 后不更換Tip頭會導致游離的Ca²⁺的減少，從而導致實驗的結果不佳。

10、陽性細胞的丟失。如果是貼壁細胞，藥物誘導后漂浮的細胞要收集起來合并檢測，這部分細胞往往是凋亡陽性的細胞，丟棄會造成陽性結果偏低。

11、在一些自噬細胞樣本中，PS外翻可能受阻，此時Annexin V不適合用于早期凋亡檢測。

● 實驗過程中陽性率偏高。可能的原因如下：

1、用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調整使用正確的儀器設置。

2、細胞本身活力太差。實驗中發現未經誘導凋亡的對照細胞經染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細胞比例過高，造成這種結果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應大于95%。

若活力偏低低，建議重新復蘇細胞，通常剛復蘇的細胞至少要傳代3次以后才能進行實驗。

3、細胞操作不當。貼壁細胞消化過程中反復劇烈吹打導致細胞膜破壞，使得假陽性偏高。細胞洗滌、重懸等過程過于劇烈導致細胞膜損傷。Annexin V-FITC會進入損傷的細胞膜，在細胞膜內部染色。

4、凋亡誘導時間過長。一般情況下誘導幾個小時就可以出現早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時以上，誘導時間過長會使營養物質耗盡，導致細胞狀態差，假陽性結果偏高。

5、固定液可導致凋亡假性增多，所以切勿固定。

6、受污染的細胞。檢查細胞是否有細菌/酵母/支原體污染。

● 凋亡細胞染色后流式檢測時細胞整體右移？

經過刺激之后，細胞通常會發生一些物理性質如體積或代謝物質的改變，導致細胞右移，是一種常見的現象。需要把門往右移。

● 如何確定細胞早期凋亡的時間點，找到正好的合理的百分比？

得到合理的百分比的時間可以利用簡單的DAPI染色或者Hochest染色，觀察加藥時間的時間點上細胞核的狀態變化，準確判斷細胞早期凋亡發生的時間點。