BTN130831 絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒
- 產(chǎn)品/服務(wù)：BTN130831 絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒
- 型 號(hào)：BTN130831
- 品 牌：百奧萊博
- 單 價(jià)：面議
- 更新日期：2023-04-19
- 有效期至：長(zhǎng)期有效
- 瀏覽次數(shù)：934
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
北京百奧萊博供應(yīng)的絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒用于科學(xué)研究，我公司的絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購(gòu)。...
產(chǎn)品詳細(xì)介紹
特別提示：包括絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
產(chǎn)品名稱：絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒
英文名稱：Filamentous fungal mitocho
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN130831
產(chǎn)品規(guī)格：15次
線粒體是重要的、負(fù)責(zé)能量產(chǎn)生的其重要的細(xì)胞器。對(duì)絲狀真菌線粒體進(jìn)行生化，遺傳和分子生物學(xué)研究都需要行線粒體純化。本產(chǎn)品就是基于密度梯度離心的，專門用于從絲狀真菌葉片中純化完整線粒體、再?gòu)闹屑兓€粒體DNA的試劑盒。
試劑盒特點(diǎn)：
1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。
2. 所得線粒體可用于后續(xù)的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析、線粒體DNA和線粒體RNA純化。
3. 本產(chǎn)品足夠15次線粒體純化和15次線粒體DNA提取，每次可處理10-20g菌絲體，能得到1-5mg左右線粒體。
4. 已經(jīng)成功用于Aspergillus candidus、Aspergillus nidμLans、Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Penicillium chrysogenum、Rhizopus stononifer等絲狀真菌。
試劑盒組成：
| 成分 | 規(guī)格 |
| 溶液A | 250mL×2 |
| 成分B | 150g |
| 溶液C | 120ml |
| 帶柄尼龍濾膜 | 1個(gè) |
| 通用線粒體DNA溶液A | 10ml |
| 通用線粒體DNA溶液B | 5ml |
| 通用線粒體DNA溶液C | 15ml |
| 說明書 | 1份 |
儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸和保存，保存期限一年。
使用方法：
注意：純化DNA提取用的線粒體的要求比純化功能研究用的線粒體的要求要低，但整個(gè)操作還是zuì好在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液zuì好在4℃預(yù)冷，離心zuì好要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計(jì)算。
一：菌絲的搖瓶培養(yǎng)
1. 使用合適的絲狀真菌培養(yǎng)基，接種孢子至終濃度為2×10E6/mL。一般100mL液體培養(yǎng)基可以得到0.8-1.2g菌絲體，而本方法一次可以處理10-20g菌絲體，故zuì好一次培養(yǎng)1-2升。
2.在合適的溫度(如25℃、30℃或37℃，根據(jù)真菌不同而不同)250rpm/min搖晃培養(yǎng)16-20小時(shí)。
3. 用多層紗布或多層過濾紙過濾收集菌絲，用冰浴的自備去離子水洗滌菌絲三次去除殘留的培養(yǎng)基。
4. 用吸水紙吸干菌絲的水分，稱重后立即使用。如果在-80℃或液氮長(zhǎng)期放置，線粒體回收效率將減低。
二：線粒體粗提液的制備
5. 制備溶液A工作液：每次提取需150mL溶液A工作液，制備方法是將20mL溶液A和130mL自備去離子水混合，冰上預(yù)冷即可。
6.在200mL燒杯中，加入100mL預(yù)冷的溶液A工作液，再加入新制備的菌絲體，然后全部轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機(jī)(家用果汁勻漿機(jī))中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌絲按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿10秒。注意：還可以選擇Dounce玻璃勻漿器，Polytron勻漿機(jī)和研磨(加玻璃珠)等方法，但它們單次處理量一般都較小，需多份處理再匯集。
7. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，用預(yù)冷的200mL量筒收集穿透液。
8. 將剩下的菌絲體轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機(jī)中，再加入40mL預(yù)冷的溶液A工作液，低速勻漿10秒，用上步的帶柄尼龍濾膜過濾，用預(yù)冷的200mL量筒收集穿透液。注意：帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。
9. 將穿透液分到4個(gè)預(yù)冷的50mL的塑料離心管中(每個(gè)約35mL)。
10.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 4000g離心10分鐘，小心轉(zhuǎn)移上清(含線粒體的部分)到4個(gè)新的離心管中。沉淀含細(xì)胞核和未裂解的細(xì)胞，可以棄之不用。如果要用于純化細(xì)胞核DNA，則可以放-80℃長(zhǎng)期保留。
11. 將含上清液的4個(gè)離心管在4℃ 10000g離心20分鐘。
12. 每個(gè)離心管中加2.5mL預(yù)冷的溶液A工作液重懸線粒體沉淀并匯集(共約10mL)，此為線粒體粗提液。
13. 如果直接用線粒體粗提液提取線粒體DNA，容易有細(xì)胞核DNA污染。
具體步驟是：在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 10000g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀為線粒體，直接用于第三步的線粒體DNA提取。
14. 如果需要高純度、無(wú)污染的線粒體DNA，則需要用密度梯度離心法將完整的線粒體和其他細(xì)胞碎片進(jìn)一步分離。具體見下步線粒體精提液的制備。
三：線粒體精提液的制備(密度梯度離心法)
15. 制備重液和輕液：將4.1克成分B干粉加到6.3mL溶液C中，充分搖晃混勻得10mL重液。將4.1克成分B干粉加到6.3mL去離子水中，充分搖晃混勻得10mL輕液。
16.在50mL塑料離心管中先加入10mL重液，再在其上輕輕加上10mL輕液，zuì后加上第11步所得的約10mL線粒體粗提液。
17. 加平衡離心管后在水平轉(zhuǎn)子冷凍超速離心機(jī)上4℃ 43000g離心2小時(shí)，重液和輕液間的帶為完整線粒體。
18. 用廣口吸管小心將線粒體轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等倍體積的預(yù)冷的溶液C，輕柔混勻。取少量在相差顯微鏡下檢查線粒體完整性。
19.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 19000 g離心20分鐘，小心將上清吸出后，線粒體沉淀可以直接用于DNA提取。
四：線粒體DNA提取
20. 將600μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液A加入到上步得到的線粒體沉淀中并吹打混勻，然后轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中。
21. 65℃放置5分鐘。
22. 加入300μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液B，震蕩混勻10-30秒。
注意：溶液B非常粘稠，可以將其預(yù)熱到65℃并剪掉一截槍頭后再取。
23. 加入200μL自備的lǜ仿，震蕩混勻10-30秒。
24. 12000g室溫離心3分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。
25.小心轉(zhuǎn)移上清液(約0.8mL)到一個(gè)新的1.5mL離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。
26. 加入1倍體積的通用線粒體DNA提取試劑盒溶液C，顛倒30次混勻。
27. 12000g室溫離心5分鐘，小心棄上清液。
28.在離心管中加入1mL自備的75%乙醇，震蕩30秒。
29. 12000g室溫離心1分鐘，小心棄上清液。
30. 12000g室溫離心半分鐘，殘留液體將匯集在管底。
31. 用洗液槍吸棄管底殘留液(約50μL)。
32. 加50-100μL自備的TE緩沖液，溶解DNA沉淀即得線粒體DNA溶液。直接取5-10μL電泳檢測(cè)，其余放直接使用或放-80℃冰箱備用。
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